Moderne Analysenmethoden zur Charakterisierung komplexer Kohlenhydrate: Hyaluronsäurefragmente und Alkylpolyglykoside

Abstract

Der Einsatz komplexer Kohlenhydrate, sei es als Wirk- oder Hilfsstoff, in pharmazeutischen Produkten setzt eine umfangreiche Charakterisierung dieser Stoffgemische auf molekularer Ebene voraus. Daher kommt geeigneten analytischen Methoden, die Erkenntnisse über die genaue Produktzusammensetzung liefern, große Bedeutung zu. Im Mittelpunkt der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit stand die Charakterisierung von Hyaluronsäurefragmenten (HAF) und Alkylpolyglykosiden (APG) unter Einsatz moderner Analysenmethoden, wie Kapillarelektrophorese (CE), Massenspektrometrie (MS) und ihre Kopplungsmethoden (LC-MS, CE-MS), Gelpermeationschromatographie (GPC) und Rheologie. Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit dem Abbaumechanismus der zur Herstellung der HAF aus Hyaluronsäure (HA) eingesetzten Hyaluronat Lyase (HA Lyase) aus Streptococcus agalactiae, Stamm 4755. Dabei stellte sich die Frage, ob das verwendete Enzym HA in endo-, oder exolytischer Weise spaltet. Durch die Kombination der verschiedenen Verfahren konnten die untersuchten HA-Abbauprodukte als polydisperse Gemische charakterisiert werden, bei denen neben HAF mittlerer Kettenlänge ein großer Anteil an Oligosacchariden vorliegt, wobei die Verteilung durch die jeweiligen Abbaubedingungen bestimmt wird. Online CE/ESI-MS Kopplungsergebnisse belegten erstmalig die ungewöhnliche Elutionsreihenfolge (von kleinen zu großen Molekülen) der HA-Moleküle. Mit Hilfe einer LC/ESI-MS-Kopplung erfolgte die Quantifizierung der HAF in pharmazeutischen Formulierungen. Die untersuchte HA Lyase aus S. agalactiae, Stamm 4755, konnte als Endoglykosidase charakterisiert werden. Mittels LC/ESI-QTOF-MS wurden komplexe Mischungen industriell hergestellter Alkylpolyglykoside (Plantacare®), auch in Anwesenheit anderer Tenside, charakterisiert. Die Alkylkettenlängenverteilung und der Oligomerisationsgrad des Oligosaccharidanteils können dadurch ermittelt und mit physiko-chemischen Eigenschaften des Produkts korreliert werden.

The use of complex mixtures of carbohydrates in pharmaceutical formulations makes a specific characterization of these substances necessary. Therefore, the development of analytical methods for examination of product composition at the molecular level is required. This work focused on the characterization of complex mixtures of hyaluronic acid fragments (HAF) and alkyl polyglycosides (APG) by means of modern analytical methods, such as capillary electrophoresis (CE), mass spectrometry (MS) and its hyphenation modes (LC-MS, CE-MS), gel-permeation chromatography (GPC) and rheology. Additionally, investigations concerning the mode of action of hyaluronate lyase (HA lyase) from Streptococcus agalactiae, strain 4755, acting on hyaluronic acid (HA) were carried out. Special attention focused on the way in which HA lyase cleaves HA at certain glycosidic linkages (endolytic / exolytic). The combination of different methods showed that HA degradation by the examined enzyme yielded polydisperse mixtures of HAF and oligosaccharides of different size. However, the obtained distribution is governed by the particular digestion parameters. For the first time online CE/ESI-MS results gave evidence for the unusual elution order (from small to large oligomers) of HA molecules. Quantification of HAF in pharmaceutical formulations was carried out by LC/ESI-MS. The investigated HA lyase from S. agalactiae, strain 4755, was found to act as an endoglycosidase. Complex mixtures of industrial APG products, such as Plantacare®, and mixtures of APGs with other surfactants were analyzed by LC/ESI-QTOF-MS. From these data, the alkyl chain lengths and the degree of oligomerization of the sugar moiety can be calculated and correlated to physico-chemical properties of APG products.