Please use this identifier to cite or link to this item:
http://dx.doi.org/10.25673/3576
Title: | Optimisation of active recombinant protein production, exploring the impact of small heat-shock proteins of Escherichia coli, IbpA and IbpB, on in vivo reactivation of inclusion bodies |
Author(s): | Le, Thanh Ha |
Granting Institution: | Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg |
Issue Date: | 2005 |
Extent: | Online-Ressource, Text + Image |
Type: | Hochschulschrift |
Type: | PhDThesis |
Language: | English |
Publisher: | Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt |
URN: | urn:nbn:de:gbv:3-000008013 |
Subjects: | Online-Publikation Elektronische Publikation Zsfassung in dt. Sprache |
Abstract: | Die wesentliche Herausforderung bei der Herstellung rekombinanter Protein stellt die Steigerung der Ausbeute aktiven Produkts dar. Limitierend für die Ausbildung der korrekten dreidimensionalen Konformation wirkt im häufig verwendeten Wirtsorganismus Escherichia coli die Bildung von inclusion bodies, d.h. aggregierten Ablagerungen unvollständig gefalteter Proteine. In dieser Arbeit sollte die Reaktivierung von Proteinen aus inclusion bodies innerhalb der lebenden Zelle als neue Möglichkeiten zur Ausbeuteverbesserung biologisch funktioneller rekombinanter Proteine in Escherichia coli untersucht werden. Diese Zielsetzung beinhaltet zum einen die Umsetzung dieses Ansatzes in Prozesse zur Produktion von α-Glukosidase aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae in Schüttelkolben und Bioreaktor einschließlich der Optimierung der Kultivierungsparameter sowie der vergleichenden Untersuchung von Prozessen zur unmittelbaren Produktion aktiven Produkts, zum anderen die Aufklärung der Rolle der kleinen Hitzeschock-Proteine von E. coli, IbpA und IbpB, für den Schutz der Zelle und beim Metabolismus der inclusion bodies. IbpA und IbpB kommen in inclusion bodies zahlreicher rekombinanter Proteine vor und sollen zur Beschleunigung der Disaggregation beitragen. Wesentliche Prozessparameter zur Optimierung der Produktion sind spezifische Temperatur und Wachstumsrate. Die für das Wachstum optimale Temperatur von 37°C förderte die Bildung von inclusion bodies, während Anzucht bei einer Temperatur von 30°C oder darunter die Akkumulation löslicher α-Glukosidase erlaubte. Im Schüttelkolben, wo die Wachstumsrate eine Funktion der Temperatur ist, war bei 24°C die spezifische α-Glukosidase-Aktivität höher. Wegen der Wachstumsbeeinträchtigung bei niedriger Temperatur war allerdings die volumetrische Aktivität bei 24°C und 30°C gleich. Die zur Produktion geeignete Kultivierungstemperatur lag also bei 30°C. In Kultivierungen mit limitierender Glukosefütterung kann die Wachstumsrate über eine exponentiell mit der Zeit ansteigende Fütterungsrate unabhängig von der Temperatur eingestellt werden. Die erreichbare spezifische α-Glukosidase-Aktivität war bei langsamem Wachstum (µset 0,12 h-1) bei 37°C bzw. 30°C sechs- bzw. zweifach höher als bei schnellem Wachstum (µset > 0,18 h-1); gleichzeitig wurde die Bildung von inclusion bodies reduziert. Da zu niedrige Wachstumsraten die Biomassebildung verzögern würden, wurde die höchste volumetrische Produktausbeute und Produktivität mit µset = 0,12 h-1 erzielt. Disaggregation der inclusion bodies und die Akkumulation aktiver α-Glukosidase wurde durch den Stopp der Proteinsynthese und/oder Temperaturabsenkung initiiert. Im Schüttelkolben mit Komplexmedium hing die Reaktivierungseffizienz vom Temperaturprofil ab; als effizient erwiesen sich 42°C während der Produktion und 30°C für die Reaktivierung. Verglichen mit der direkten Synthese aktiver α-Glukosidase bei 30°C lag die Ausbeute um 45% höher: die spezifische Aktivität erreichte nach 5 h Induktion 3 U mg-1 bei direkter Produktion bzw. 4.5 U mg-1 bei Reaktivierung unter dem optimalen Temperatur-Profil. In Zufütterungskultivierungen auf definiertem Medium war die direkte Produktion nach der Optimierung bereits sehr effizient; 5 h nach Induktion erreichte die spezifische Aktivität 6 U mg-1 und stieg auf 9 U mg-1 am Ende der Kultivierungen. Für die Akkumulation aktiver α-Glukosidase nach Temperatursprung erwiesen sich die gleichen Bedingungen als geeignet wie für die direkte Produktion; daher erbrachte die Absenkung der Temperatur gleichzeitig Induktion die höchste Aktivität. Während nach bisherigen Befunden ibpAB bei Kultivierungstemperaturen von bis zu 50°C entbehrlich ist, war das Wachstum des ibpAB-Deletionsstammes während der α-Glukosidase-Produktion schon bei 30°C beeinträchtigt. Die Hitzeschockantwort, die während der Produktion von rekombinanter α-Glukosidase induziert wird, war im ibpAB-Deletionsstamm intensiviert, was am deutlichsten anhand der durch 2D-Gelelektrophorese bestimmten Konzentrationen der Hitzeschockchaperone DnaK und ClpB wurde, und war entsprechend bei ibpAB-Überexpression gemäßigt. Die kleinen Hitzeschockprotein üben also eine wichtige Funktion zum Schutz der Zelle bei der Akkumulation von aggregationsbereiten Proteinformen aus. Die Funktion von IbpA und IbpB im Inclusion-bodies-Metabolismus wurde untersucht. Nach dem Stopp der Proteinsynthese wurden die α-Glukosidase-inclusion bodies in einem dnaK- und clpB-abhängigen Schritt disaggregiert und dann reaktiviert oder abgebaut. Hohe IbpA/IbpB-Konzentrationen hemmten die Disaggregation bei höheren Temperaturen und verhinderten dabei den Abbau von α-Glukosidase. Die Dissagregation-Kinetik oder Abbau-Kinetik mit verschiedenen Konzentrationen von IbpA/IbpB bei niedrigen Temperaturen waren dagegen ähnliche wie ohne IbpA/IbpB. Nach Produktion bei 42°C wird bei ibpAB-Überexpression die Zeitspanne der Reaktiverung verlängert und dadurch die Ausbeute aktiver α-Glukosidase um 25 % gesteigert im Vergleich mit ohne ibpAB-Überexpression. IbpA/IbpB sind also effizient Werkzeug bei höheren Temperaturen um Proteine-Reaktivierung zu bewältigen und um den Abbau zu verhindern. For the production of recombinant proteins, the major challenge lays in mMaximising the yield of biologically functional proteins is still a challenge for recombinant protein production. In the most commonly used host Escherichia coli, proper protein folding is compromised by the formation of inclusion bodies, i.e. aggregated deposits of denatured proteins. In this thesis, the production of active α-glucosidase from the yeast Saccharomyces cerevisiae was optimised in two aspects. First the cultivation parameters that optimise the productivity were determined and their influence on the cultivation process was analysed. Second the new approach of reactivating the inclusion bodies inside the living cell was studied. Cultivations processes implementing this approach were developed in bench-top and pilot scale for production of α-glucosidase and the influence of cultivation parameters on the productivity was analysed. Inclusively, Specifically the main part of the thesis was concentrated on investigating the roles of the small heat shock proteins of E. coli, IbpA and IbpB, in the metabolism of inclusion bodies and in cell protection metabolismwere investigated. Small heat shock proteins IbpA and IbpB have been found tightly associated with inclusion bodies of numerous recombinant proteins and were suggested implicated to promote the rapidchange the kinetics of inclusion bodies disaggregation. α-Glucosidase from the yeast Saccharomyces cerevisiae was chosen as model protein throughout the work due to some reasons, first the yield of soluble α-glucosidase and the formation of inclusion bodies is strongly depended on cultivation parameters. Second the ibpAB operon is induced during recombinant α-glucosidase production, which indicates the enhanced need for IbpA and IbpB. Last the native state of α-glucosidase can be easily monitored by enzymatic assay. Important parameters that influence the α-glucosidase folding are temperature and growth rate. Temperatures that maximise the growth rate almost extensively promote aggregation of α-glucosidase, while temperatures of 30°C or below were compatible with production of active α-glucosidase. Moreover, as the growth rate is a function of temperature in shake flask experiments, maximum specific α-glucosidase activities were obtained at 24°C. But since the growth was decelerated at lower temperature, the volumetric activities resulting from specific activity and cell density were equally high at 24°C and 30°C. The influence of cultivation parameters was studied in shake flasks and in bioreactors. The fFed-batch cultivations with exponentially increasing feeding rates to enable culture growth with the constant growth rates. of the cultures could isolate the effect of specific growth rate of that of temperature. The inverse correlation of inclusion bodies formation with specific growth rate was observed at the set specific growth rate µset in the range from 0.06 h-1 to 0.22 h-1, while the yield of active product was inversely correlated only in the range of specific growth rate higher than 0.12 h-1. The specific growth rate set by the feeding rate had a strong impact on the accumulation of active α-glucosidase. The specific activity was six fold higher at low growth rate (µset 0.12 h-1) than at higher growth rate (µset > 0.18 h-1) at 37°C. As slow growth affects biomass formation, the highest volumetric product yield and productivity were achieved with µset = 0.12 h-1. Disaggregation of inclusion bodies and accumulation of active α-glucosidase could be achieved by arrest of protein synthesis and/or reduction of the cultivation temperature. In shake flasks. The new protocol for production by in vivo reactivation from inclusion bodies by temperature downshift was studied, based on the possibility of inclusion bodies to disintegrate. Tthe reactivation efficiency depended on the temperature during aggregation the production and reactivation phases anddisaggregation, was more efficient highest with production at aggregation temperature of 42°C followed by reactivation and disaggregation temperature of at 30°C. By this optimised protocol, tThe final activitye yield five hours after production by this new protocol under optimised conditions was improved in shake flask and on complex LB medium was improved twofold relative to highest value by direct production at 24°Cwithout temperature downshift despite at temperature of 30°C, which was optimum for productivity of active α-glucosidase. In fed-batch cultivations on defined medium, the α-glucosidase production was very efficient: while the specific activity after five hours production reached in shake flasks experiments on complex medium 3 U mg-1 in direct production without reactivation and rose to 4.5 U mg-1 with reactivation under optimised temperature profiles, it reached already 6 U mg-1 in fed-batch cultivation under optimised condition after the same time of production and rose to 9 U mg-1 on the end of cultivation (18 h production). Since the optimised conditions for in vivo reactivation in fed-batch cultivations were the same as for direct production, the highest yield of α-glucosidase activity was achieved by temperature reduction at the same time of induction. The role of IbpA and IbpB in the metabolism of inclusion bodies, formed during α-glucosidase production was studied. While ibpAB has been found dispensable up to temperatures of 50°C, growth during α-glucosidase production was impaired in the ibpAB deletion strain. Also tThe heat shock response, which is induced during α-glucosidase production, was intensified, most obviously with the disaggregation chaperones ClpB and DnaK, and correspondingly was suppressed attenuated by overexpression of ibpAB, whereas in the ibpAB deletion strain, concomitant with growth impairment, the heat shock response was intensified, most obviously with the disaggregation chaperones ClpB and DnaK. The small heat-shock proteins thus exert an important function in cell protection under conditions of strong protein aggregation. The role of IbpA and IbpB in the metabolism of inclusion bodies formed during α-glucosidase production was also studied. After arrest of protein synthesis, α-glucosidase inclusion bodies were dissaggregated, reactivated and degraded in a clpB and dnaK dependent process. The disaggregation and degradation was decelerated by small heat shock protein IbpA/IbpB in a temperature-dependent manner. The With a high production temperature of 42°C, overexpression of ibpAB can prolong the reactivation process and increase the reactivation yield by 25 % compared with without ibpAB overexpression. |
URI: | https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/10361 http://dx.doi.org/10.25673/3576 |
Open Access: | ![]() |
License: | ![]() |
Appears in Collections: | Hochschulschriften bis zum 31.03.2009 |