Molekulare Charakterisierung des Typ III-Sekretionssystems von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

Abstract

Das Gram-negative Bakterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit bei Paprika und Tomate und einer der Modellorganismen zum Studium bakterieller Pflanzenpathogene. Das hrp ("hypersensitive response and pathogenicity")-Gencluster von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria kodiert ein Typ III-Sekretionssystem, das die Proteinsekretion in das extrazelluläre Medium sowie die Translokation von Effektorproteinen in die pflanzliche Wirtszelle ermöglicht. Unter den annähernd 20 Proteinen, die in die Typ III-Sekretion involviert sind, sind neun von ihnen zwischen pflanzenpathogenen Bakterien konserviert und bilden wahrscheinlich die Kernkomponente eines funktionellen Sekretionsapparates. Unter Zuhilfenahme eines lexA-basierenden bakteriellen Dihybridsystems wurden die Interaktionen der konservierten Proteine des Sekretionsapparates näher charakterisiert. Hierbei konnten Homo- und Heterodimerisierungen zwischen der ATPase HrcN und dem regulatorischen Protein HrcL gezeigt werden. Auch war es möglich, Interaktionen zwischen den löslichen zytoplasmatischen Domänen der integralen Membranproteine HrcU und HrcV aufzuzeigen. Der Proteinkomplex des Typ III-Sekretionssystems in der inneren bakteriellen Membran wird sehr wahrscheinlich von sechs integralen Membranproteinen aufgebaut, die bis auf HrpD5 homolog zu Komponenten des Flagellumbasalkörpers sind. Mittels des mini-Tn5-Derivates Tnpholac1 wurde die Topologie (also die Anzahl transmembraner Segmente und ihrer Orientierung in der Membran) bestimmt und zu allen sechs Proteinen ein Topologiemodell erstellt. Um genauere Aussagen über die Organisation der Operone hrpD und hrpE von Xcv zu erlangen, wurde der Transkriptionsstart von hrpD5 mittels 5'-RACE bestimmt. Eine His6-Epitop-markierte HrpD5-Variante wurde erstellt und gereinigt, um die N-terminale Sequenz des Proteins zu bestimmen.

The Gram-negative bacterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria is the causal agent of the bacterial spot disease in pepper and tomato and serves a model organism to study bacterial plant pathogens. The hrp ("hypersensitive response and pathogenicity") gene cluster of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria encodes a type III secretion system which mediates protein secretion into the extracellular medium as well as the translocation of bacterial effector proteins into eukaryotic host cells. Among the approximately 20 proteins that are involved in type III secretion nine are conserved between different bacterial species and most likely constitute for the core components of the secretion apparatus. Protein-protein interactions between these conserved proteins were characterized using a lexA-based bacterial two-hybrid system. Heterologous and homologous interactions were found between the ATPase HrcN and the regulatory component HrcL. Furthermore, interactions between the soluble domains of the integral membrane proteins HrcU and HrcV were discovered. The type III secretion apparatus in the inner bacterial membrane consists of six integral membrane proteins most of with exception of HrpD5, are homologous to components of the flagellar basal body. Membrane topologies of all six proteins were investigated using the mini-Tn5 transposon derivate Tnpholac1 and topology models were established for each protein. To achieve more information about the organisation of the hrpD-hrpE operons of Xcv the transcriptional start site of hrpD5 was determined. A His6-epitope-tagged version of HrpD5 was used to determine the translational start site.