Elimination of selectable markers genes via segregation of uncoupled T-DNAs in populations of doubled haploid barley

Abstract

Gerste ist eine der ökonomisch bedeutendsten und am weitesten verbreiteten Kulturpflanzen weltweit, und es wird erwartet, dass gentechnische Ansätze bei der weiteren züchterischen Bearbeitung dieser Art eine entscheidende Rolle spielen werden. Sobald jedoch eine transgene Pflanze generiert worden ist, wird der dazu verwendete Selektionsmarker in der Regel nicht mehr benötigt oder ist für die weitere Bearbeitung oder Nutzung des Materials sogar hinderlich. Daher ist die Entwicklung von praktikablen Methoden zur Herstellung selektionsmarkerfreier transgener Pflanzen erforderlich. In der vorliegenden Studie wurde eine neuartige Strategie verfolgt um selektionsmarkerfreie, unmittelbar homozygot transgene Gerstenpflanzen herzustellen. Dazu wurden zunächst per Agrobakterien-vermitteltem Gentransfer primäre co-transgene Pflanzen (T0) erzeugt, die nach Verwendung von zwei unabhängigen T-DNAs ein Selektionsmarkergen (hygromycinphosphotransferase) und ein Modell-Effektorgen (ß-glucuronidase) in ihrem Genom integriert haben. Es wurden zwei Agrobakterienstämme (LBA4404pSB1 bzw. AGL-1) und insgesamt sechs Binärvektoren für unterschiedliche Methoden der Co-Transformation verwendet, die entweder auf der Mischung unterschiedlicher Agrobakterien (zwei Binärvektoren in zwei Klonen des gleichen Agrobakterienstammes bzw. zwei Binärvektoren in zwei verschiedenen Agrobakterienstämmen), oder auf der Verwendung einzelner Agrobakterienklone (zwei Binärvektoren zusammen in einem Agrobakterienklon bzw. ein ‘Twin’-Vektor mit zwei T-DNAs in einem Agrobakterienklon) beruhen. Insgesamt ergaben sich dabei 14 verschiedene Varianten der Übertragung von jeweils zwei unterschiedlichen T-DNAs in unreife Gerstenembryonen, die als Zielgewebe des Agrobakterien-vermittelten Gentransfers verwendet wurden. Der Vergleich dieser Varianten ergab beträchtliche Unterschiede bezüglich diverser Aspekte der Transgenität der generierten Pflanzen. Die Eliminierung des Selektionsmarkergens und die damit einhergehende Herstellung homozygot transgener Linien wurde daraufhin durch Segregation ungekoppelt integrierter T-DNAs in Populationen doppelhaploider (DH) Linien erreicht, die mittels embryogener Pollenkultur aus den T0-Pflanzen generiert wurden. Bei der Herstellung selektionsmarkerfreier, homozygot transgener Gerste mittels Co-Transformation erwies sich die Implementation von Haploidentechnologie als geeignete Maßnahme den erforderlichen Umfang an Arbeit, Anbaufläche und Zeit erheblich zu reduzieren.