Biophysikalische und molekulargenetische Untersuchung der Dinukleotid-Bindung von Gal80 aus Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis

Abstract

Gal80 ist ein zentraler Regulator des GAL-Transkriptionsschalters der Bäckerhefe S. cerevisiae und der Milchhefe K. lactis. Die GAL-Gene werden von Gal4 aktiviert und kodieren für Enzyme, die für die Verwertung von Galaktose notwendig sind. Gal80 blockiert durch Bindung der Aktivierungsdomäne von Gal4 die Transkription der GAL-Gene. Diese Inhibierung wird in Abhängigkeit von Galaktose durch die Interaktion von Gal80 mit seinem Regulator Gal3 in S. cerevisiae aufgehoben. In S. cerevisiae katalysiert die Galaktokinase Gal1 den ersten Schritt der Galaktose-Verwertung. In K. lactis ist die Funktion von Gal1 und Gal3 in einem Protein, dem K. lactis Gal1, vereinigt. Anhand der Aminosäure-Sequenz beider Gal80 wurde ein Dinukleotid-Bindemotif, eine sogenannte Rossmann-Falte, ähnlich zu dem von Glukose-Fruktose-Oxidoreduktasen vorhergesagt. Mittels vier unabhängigen Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Gal80 Dinukleotide mit unterschiedlicher Affinität binden können. Zudem konnte In vitro gezeigt werden, dass die Dinukleotid-Bindung die Gal4-Gal80-Interaktion beeinflusst, aber die Gal1-Gal80-Interaktion nicht beeinträchtigt ist. S. cerevisiae Stämme, welche in GAL80 mutiert sind, wodurch die Dinukleotid-Bindung beeinträchtigt ist, zeigten eine reduzierte basale Expression der LAC-Gene, welche als Reporter-System dienten, unter nicht-reprimierenden (niedrig Glukose-Konzentrationen) und induzierenden Bedingungen (Galaktose). Diente Laktose als Kohlenstoffquelle konnte kein Wachstum der GAL80-Mutanten Stämme detektiert werden, was auf eine reduzierte basale Expression der LAC-Gene zurückgeführt werden könnte. Demnach könnte die fehlende oder schwächere Dinukleotid-Bindung der Gal80-Varianten eine stärkere Bindung an Gal4 zur Folge haben. Der durch die Deletion von GAL3 beobachtete long-term-adaption Phänotyp konnte durch die gal80-Varianten teilweise oder vollständig supprimiert werden. Demzufolge könnte die Dinukleotid-Bindung von Gal80 zur Diskriminierung der Bindung an Gal3 und Gal1 führen. Anhand der Untersuchungen in vitro und in vivo wurde ein Modell zum Einfluss der Dinukleotid-Bindung von Gal80 auf die basale und aktivierte Transkription der durch Galaktose-induzierbaren Gene in S. cerevisiae und K. lactis vorgeschlagen.