Expression and characterization of terpene synthases from Canabis sativa L. and Salvia sclarea L.

Abstract

Zusammenfassung der C. sativa L. Monoterpenesynthasen: Zwei mRNA kodierte trichomspezifische Monoterpensynthasen, eine (-)-Limonensynthase (CsTPS1) und eine (+)-a-Pinensynthase (CsTPS2)aus Cannabis sativa L. cv. Skunk wurden isoliert und charakterisiert, dabei konnte gezeigt werden das diese stereospezifisch sind und Dimere bilden. Die rekombinante CsTPS1 hatte einen Km von 6.25 μM und ein Kcat bei 0.09 s-1, das pH-Optimum wurde bei pH 6.5, und das Temperatureoptimum bei 40°C bestimmt. Die rekombinante CsTPS2 hatte einen Km von 4.96 μM und ein Kcat von 0.14 s-1, das pHOptimum wurde bei pH 7.0, und das Temperatureoptimum 30°C bestimmt. Der Stokesradius beider Enzyme wurde mit 4.47 nm ermittelt. Phylogenetische Analysen gruppieren beide CsTPSs mit Terpensynthasen der Angiospermfamilie, sie gehören zur Tpsb Untergruppe der Monoterpensynthasen. Die enzymatischen Produkte, (-)-Limonen und (+)-a-Pinene, wurden außerdem als naturürliche Produkte in C. sativa Trichomen gefunden. Zusammenfassung der S. sclarea L. Diterpensynthase: Eine mRNA kodierte trichomspezifische Diterpene-, Sclareolsynthase (SscTPS1) aus Salvia sclarea L. cv Trakystra, wurde zum ersten Mal isoliert und partiell charakterisiert, dabei konnte gezeigt werden das diese als Oligomer möglicherweise als Pentamer vorliegt. Außerdem trat ein promiskutives Verhalten gegenüber verschiedenen Substraten auf. Neben GGPP als Diterpensynthasesubstrat war es SscTPS1 möglich eine große Anzahl von Mono- und Sesquiterpenoiden aus GPP, NPP and FPP zu bilden. Der Stokesradius des Enzyms wurde mit 6.32 nm ermittelt. Phylogenetische Analysen gruppiert SscTPS1 mit Terpensynthasen der Angiospermfamilie, sie gehört zur Tpsc Untergruppe und ist mechanistisch gesehen eine Klasse II Diterpensynthase. Die enzymatischen Produkte sind alle als natürliche aus S. sclarea L bekannt.