The genetic characterization of RNA-directed transcriptional gene silencing in Arabidopsis thaliana

Abstract

Das Ziel war die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die am RNA-vermittelten transkriptionellen Silencing in A. thaliana beteiligt sind. Dazu wurde ein Transgensystem verwendet, in dem die Expression des Kanamycinresistenszgens NPTII unterdrückt ist und die resultierenden Wildtyppflanzen sensitiv auf Kanamycin sind. EMS-mutagenisierte, transgene M2 Samen, wurden auf Kanamycinrestienz getestet. Die mutierten, für die Kanamcinresistenz verantwortlichen Gene wurden mittels Map-based Cloning und Next Generation Sequencing identifiziert. Die Mutanten wurden in in sechs Komplementationsgruppen (nrd1 bis nrd6) eingeordnet. Durch Einbringen eines Wildtyp-Alleles wurde bestätigt, dass nrd1 und nrd3 loss of function Allele von IDN2 bzw. DRM2 sind. Hohe Mengen an NPTII-Protein in F1-Individuen aus Kreuzung unabhängiger nrd2Allele, bestätigten, dass es sich bei diesen um nrpd2a-Mutanten handelt. Aus Northern Blot Analysen wurde geschlossen, dass IDN2 nach der siRNA Synthese im RdDM agiert.

The aim of this work was the identification and functional characterization of genes involved in RNA-directed transcriptional gene silencing (RdTGS) via induced loss-of-function mutants in A. thaliana. To isolate these, a transgene system was used in which the kanamycin resistance gene NPTII was silenced by RdTGS. EMS-mutagenizedtransgenic M2 seeds were screened for individuals displaying kanamycin resistance. The mutated genes causing a release of NPTII silencingin the isolated mutants were determined by map-basedcloning and nextgeneration sequencing. The mutants were grouped into six complementation groups (nrd1 to nrd6). Nrd1, nrd2 andnrd3 were confirmed to be idn2, nprd2a and drm2 loss-of-function alleles, respectively, either by introduction of transgenes carrying wild type alleles of the respective candidate genes or in crosses between independent mutant lines. Furthermore, based on Northern blot analysis, it was concluded that IDN2 acts downstream of siRNA formation in RdTGS.