Calystegine in Solanum tuberosum L. - Klonierung, Expression und Charakterisierung der Tropinonreduktasen I und II, putativer Enzyme des Tropanalkaloidstoffwechsels

Abstract

Calystegine sind Nortropanalkaloide, die in verschiedenen Arten der Solanaceen detektiert wurden, die klassische Tropanalkaloide wie Hyoscyamin und Scopolamin akkumulieren. Sie akkumuliern auch in Solanum tuberosum (L). Kartoffelpflanzen enthalten Calystegine in Blättern, Sproßachsen, Blüten, Früchten und Wurzeln. Calystegin A3 und B2 sind die Hauptbestandteile. Die höchsten Konzentrationen wurden in den Keimen bestimmt, die sich aus den Keimaugen entwickeln. In 3 mm langen Keimen akkumulieren 3,3 mg Gesamtcalystegin pro g/Frischmasse. Es wird angenommen, daß die Calystegine sich vom Tropanalkaloidstoffwechsel ableiten. Es wurden verschiedene cDNA's aus S. tuberosum isoliert, die eine hohe Homologie zur pseudotropinbildenden Tropinonreduktase (TRII) und zur tropinbildenden Tropinonreduktase (TRI) besitzen. Die equivalenten Aminosäuresequenzen zeigen typische Motive der kurzkettigen Dehydrogenasen/Reduktasen, der sogenannten SDR-Enzymfamilie. Die rekombinanten TRI- und TRII-Proteine wurden in E. coli herterolog exprimiert und katalysierten die Reduktion des Tropinons zum Tropin (TRI) und Pseudotropin (TRII). Das TRII-Protein hat einen ähnlichen Km-Wert, pH-Optimum und Substrat- und Cosubstratpreferenzen wie die aus der Literatur bekannten TRII-Proteine. Das TRII-Gen ist in Wurzeln, Knollen und oberirdischen Geweben exprimiert. Die TRI-mRNA Expression wurde ebenfalls analysiert.

Calystegines are nortropane alkaloids that are found in Solanaceae containing the classical tropane alkaloids hyoscyamine and scopolamine, and in other Solanaceae such as Solanum tuberosum (L). Potato plants contain calystegines in leaves, stems, flowers, fruits and roots. Calystegines A3 and B2 are the main constituents. Highest concentrations were measured in sprouts emerging from the tubers. In 3 mm long sprouts 3.3 mg total calystegines per gram fresh mass were detected. Calystegines are assumed to derive from the classical tropane alkaloid pathway. We isolated several cDNA's from S. tuberosum with high homology to the pseudotropine forming tropinone reductase (TRII) and tropine forming tropinone reductase (TRI). The equivalent amino acid sequences show typical motifs of a short chain dehydrogenase (SDR). The recombinant TRI and TRII proteins expressed in E. coli catalyzes tropine (TRI) or pseudotropine (TRII) formation from tropinone. The TRII protein has a Km-value, a pH-optimum, substrate and co-substrate preferences similar to those reported for the TRII enzymes from other Solanaceae species. The TRII gene is expressed in roots, tubers and aerial parts of potato. TRI mRNA expression was also analyzed.