Konfokale Kalziumsignale in einem in vitro-System mit Vesikeln des sarkoplasmatischen Retikulums

Abstract

Für die elektromechanische Kopplung in Herz- und Skelettmuskel spielt die kalziuminduzierte Kalziumfreisetzung aus den Membranen des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) eine wichtige Rolle. Das SR ist nicht nur an der Entstehung synchronisierter Kalziumtransienten, sondern auch elementarer Ereignisse, wie Kalziumoszillationen, Kalziumsparks und Kalziumwellen beteiligt. In einem neu entwickelten artifiziellen System von immobilisierten SR-Vesikeln (Skelettmuskel adulter Hausschweine) in Agarose-Gel wurde mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie gezeigt, dass die Kalziumsignalausbreitung in Form von Wellen unmittelbar an das Vorhandensein des SR gebunden ist. Spontane oder stimulierte räumlich-zeitliche Kalziumstrukturen wurden in Präparaten mit inhomogener und homogener Verteilung von Zellorganellen beobachtet. Die elementaren Ereignisse der Kalziumfreisetzung unterliegen den Prinzipien der Selbstorganisation in erregbaren Medien. Die Kalziumwellenausbreitung wurde in Abhängigkeit unterschiedlicher totaler Kalziumkonzentrationen im System, unterschiedlicher Vesikelproteinkonzentrationen sowie von zusätzlich eingebetteten Mitochondrien untersucht. Durch Applikation von Thapsigargin, ein Hemmstoff der SR-Ca-ATPase, oder von Antimycin A, ein Hemmstoff der mitochondrialen Atmungskette, konnte die Kalziumsignalausbreitung signifikant verändert werden. Mit Hilfe der Geschwindigkeits-Krümmungs-Beziehung wurden scheinbare Ca2+-Diffusionskoeffzienten im System mit und ohne Mitochondrien bestimmt. Das in vitro-System eröffnet neue Möglichkeiten der Untersuchung des Einflusses morphometrischer Parameter, von Mitchondrien und pharmakologischer Substanzen auf die Entstehung elementarer Signale der Kalziumfreisetzung aus den Membranen des SR.

In different cell types, activation of signal transduction pathways leads to the generation of calcium oscillations and waves. Due to this important impact for cellular function, calcium waves are subject of intensive investigations. To study interactions of cell organelles without influence of the cell membrane, calcium waves observed in an in vitro system of a suspension of sarcoplasmic reticulum (SR) vesicles, embedded in an agarose gel. Spatio-temporal calcium patterns were visualized by confocal laser scanning fluorescence microscopy. Calcium signalling depends on the concentration of the total calcium in the system in biphasic manner and also on the presence of well-coupled mitochondria. An inhibition of the SR Ca-ATPase with thapsigargin reduced the propagation velocity of the calcium waves. The application of antimycin A to the system of SR vesicles and mitochondria seems to transform the extended agarose gel system to one with lacks mitochondria. It is demonstrated that gel-immobilized cell organelles reveal features of an exitable medium. This study is also aimed to the determination of apparent diffusion coefficients of calcium in the agarose gel with SR vesicles either in the absence or in the presence of mitochondria by means of velocity-curvature relationship for three-dimensional waves.