Matrix-bound peptides modeling protein-protein interactions

Abstract

Die Zielstellung der hier vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob zwei Oligopeptide, die die linearen Bindungsepitope zweier interagierender Proteine darstellen, und dabei auf festem Trägermaterial an einem einzelnen Trägermolekül so fixiert sind, dass sie sich gegenüber stehen, die Konformation der interagierenden Epitope der nativen Proteine nachahmen. Einleitende Untersuchungen wurden an Protein-Peptid Komplexen mit bekannten Strukturen durchgeführt (z.B. Streptavidin/Strep-tag II und 14-3-3/ Phosphopeptid). Durch parallele Synthese auf festem Trägermaterial von Arrays zweier unterschiedlicher Peptidketten an einem Trägermolekül, die die interagierenden Zentren beider Bindepartner darstellen, war es möglich, durch eine neu etablierte Methode, dem Janus-Peptidarray, Peptid-Peptid Interaktionen nachzuweisen. Weitere Protein-Protein Interaktions-Komplexe (z.B. FKBP12/FAP48 and FKBP12/EGF Rezeptor, zytosolische Domän) wurden mit einer Kombination aus Standard SPOT Synthese und Janus-Peptidarray um die Grundlage für Protein-Protein Interaktionszentren zu entschlüsseln. Die hier erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass zwei Peptide, die potentiell miteinander interagieren, auch immobilisiert auf festem Trägermaterial interagieren, wobei diese Interaktion durch den Janus-Peptidarray detektierbar gemacht werden konnte. Die dadurch entstandenen Möglichkeit, wichtige Kontaktstellen von Protein-Protein/Peptid Komplexen durch den Janus-Peptidarray analysieren zu können, zeigt deutlich, dass Matrix-gebundene Peptid-Peptid Interaktionen Protein-Protein Interaktionen nachahmen können. Fluoronierte Proline können mittels 19F NMR Spektroskopie detektiert werden und bieten damit die Möglichkeit, Aussagen hinsichtlich der Konformation zu treffen. Die Dynamik der cis/trans Isomerisierung der N-terminal vor der (4)-Fluoroprolin liegenden Prolylbindung liefert Informationen über den konformationellen Zustand des Peptides, der durch PPIasen verändert werden kann. Die Umgebung des (4S)-Fluoroprolins zeigt sich dabei als das am besten geeignet für die Untersuchungen der cis/trans Isomerisierung matrix-gebundener Oligopeptide, weil es charakteristische Eigenschaften hinsichtlich der Katalyse durch Cyp18 zeigt und andererseits einen hohen Anteil an cis Isomer hat.

The main aim of this work is to answer whether two oligopeptides, representing the linear binding epitopes of two interacting proteins, anchored side-by-side on solid supports on a single carrier molecule mutually orient chains and whether these matrixbound oligopeptides mimic the conformation of interacting epitopes of native proteins. We started with the investigation of protein-peptide complexes with known structures (e.g. streptavidin/Strep-tag II and 14-3-3/phosphopeptides), by parallel synthesizing arrays of two different peptide chains containing interacting sites from both binding partners on solid supports via a single carrier molecule, and analyzing the peptide-peptide interactions by newly established methodology, Janus-peptide array. Further, proteinprotein interacting complexes (e.g. FKBP12/FAP48 and FKBP12/EGF receptor cytosolic domain) were investigated by combining standard SPOT synthesis and Janus-peptide array in deciphering the code of protein-protein interaction sites. The results obtained indicated that two peptides, potentially interacting, do interact with each other when immobilized on a solid support, and such interaction is detectable by Janus-peptide array. The capability in analyzing the main contact sites of protein-protein/peptide complexes by Janus-peptide array strongly indicated that matrix-bound peptide-peptide interactions could mimic protein-protein interactions. Fluorinated prolines can be detected by 19F NMR spectroscopy and provide conformational information. Dynamics of cis/trans isomerization of prolyl bond preceding (4)-fluoroprolines gives rise to information on the conformational state, which can be altered by PPIases. The (4S)-fluoroproline moiety appears to be most suitable for the investigation of cis/trans isomerization of a matrix-bound oligopeptides chain because of its unique properties in Cyp18 catalysis and its high content of cis isomer.