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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3468
Title: Untersuchungen zur Optimierung der Serinprotease Trypsin für die Substratmimetika-vermittelte Peptidsynthese
Author(s): Rall, Kathrin
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2004
Extent: Online-Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000007042
Subjects: Elektronische Publikation
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Die vorliegende Dissertation befaßt sich mit der Optimierung des anionischen Rattentrypsin II für die enzymatische Peptidsynthese auf der Basis des Substratmimetika-Konzeptes. Schwerpunkt der Arbeit war zum einen die hierfür notwendige Verbesserung des Verhältnisses von Esterase-/Amidaseaktivität ausgehend vom nativen Katalysator. Im Mittelpunkt der durch ortsgerichtete Mutagenese vorgenommenen Modifizierungen standen verschiedene Strukturbereiche des anionischen Rattentrypsins, die sowohl die katalytische Triade, die primäre Bindungstasche, die S1'-Bindungsregion sowie jene Aminosäuren einschließen, die in den Konformationswechsel vom Präcursor zur korrespondierenden Protease involviert sind. Aus einer Bibliothek von Substratmimetika mit variabler Abgangsgruppe konnten für die Trypsin-Varianten Präferenzen für bestimmte Abgangsgruppenstrukturen ermittelt werden. Basierend auf diesen Befunden erfolgten weiterhin Acyltransferexperimente, die Rückschlüsse auf die relative Amidaseaktivität der neuen Katalysatoren zuließen. Die aus den Versuchen als bislang optimal hervorgehende Variante Trp D189K/K60E wurde weiterhin enzymologisch charakterisiert. Unter Verwendung dieses neuen Enzyms gelang erstmals eine Trypsin-katalysierte Verknüpfung von im P1-Rest D-konfigurierten 4-Guanidinophenylestern auf Acylakzeptoren mit sensitiven Spaltstellen. Darüber hinaus konnte das synthetische Potential der Variante Trp D189K/K60E in ausgewählten Segmentligationen bei der Herstellung von Polypeptiden und für die selektiv N-terminale Modifizierung von Peptiden und Proteinen wie Ribonuklease A und E.coli Parvulin 10 beschrieben werden.
This dissertation reports on the optimization of anionic rat trypsin II for use in peptide synthesis on the basis of the substrate mimetic concept. Site-directed mutagenesis was used to design trypsin variants with decreased cleavage activity. Several regions within the trypsin structure were modified like primary specificity pocket, S1'-binding site, catalytical triad and amino acids wich play a crucial role during the activation process. Hydrolysis studies using a library of substrate mimetics with different leaving groups were performed to determine a preference of the enzymes for a specific leaving group structure.To examine the effect of mutations on enzymatic synthesis, model reactions were performed using the specific substrate mimetic and appropriate specific amino-acid-containing peptides as acyl acceptors. Finally the optimized catalyst Trp D189K/K60E was characterized enzymologically and used successful in fragment ligations to synthesize polypeptides. For the first time trypsin catalyzed coupling of P1- D-configured 4-Guanidinophenyl esters and specific amino-acid-containing peptides could be realized. More over the synthetic utility of this new biocatalyst could be demonstrated with the selectiv N-terminal modification of peptides and proteins like Insulin, RNase A and E. coli Parvulin 10.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/10253
http://dx.doi.org/10.25673/3468
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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