Molekulare und biochemische Untersuchungen zu Komponenten der D-Prolin-Reduktase und Glycin-Reduktase von Clostridium sticklandii - Analyse der Pyruvyl-bildenden Proenzyme GrdE und PrdA der Glycin und D-Prolin-Reduktase

Abstract

Clostridium sticklandii ist ein anaerobes, Aminosäure-verwertendes Bakterium, welches Glycin und D-Prolin in Form der Stickland-Reaktion verwertet. Die Glycin- and D-Prolin-Reduktase enthalten Selenocystein und eine Pyruvyl-Gruppe, die aus einem Cystein-Rest durch die Proprotein-Spaltung gebildet wird. Für die Analyse der Proprotein-Spaltung der überexprimierten Proproteine GrdE und PrdA der Glycin- and D-Prolin-Reduktase existiert ein in vitro System. Das Proprotein GrdE aus C. sticklandii wurde an konservierten Aminosäuren im Bereich der Spaltstelle mutiert. Die Untersuchung der Mutanten auf ihre in vitro Spaltung zeigte, dass die Cystein-Reste an Position 242 und 246 in GrdE entscheidend für die Spaltung sind. Bei der in vitro Spaltung weiterer GrdE-Mutanten konnte nur ein geringer Einfluss auf die Spalteffizienz nachgewiesen werden. Untersuchungen mit verschieden großen Spaltdomänen von GrdE fusioniert mit MalE und Thioredoxin zeigten, dass die Spaltdomäne insgesamt mindestens 30 Aminosäuren umfassen sollte, damit GrdE effizient und spezifisch in vitro gespalten werden kann. Im D-Prolin-Reduktase-Operon codiert das Gen prdC für das putativ Elektronen-tranferierende Protein PrdC. PrdC konnte aus C. sticklandii angereichert und es konnte nachgewiesen werden, dass PrdC die Elektronen von NADH zur D-Prolin-Reduktase zur Reduktion von D-Prolin überträgt. Zur Untersuchung der Regulation der D-Prolin-Reduktase wurde die Transkription der Gene für ein putatives Repressorprotein (PrdX), ein konserviertes σ54-Aktivatorprotein (PrdR) und ein σ54-Promotor mittels primer extension and RT-PCR analysiert. Die Experimente zur Etablierung eines Transformationssystems für C. sticklandii and E. acidaminophilum wurden fortgeführt, um die mutierten und fusionierten Proproteine in vivo untersuchen zu können.

Clostridium sticklandii is an anaerobic, amino acid fermenting bacterium that degrades glycine and Dproline in a typical Stickland reaction. Glycine- and D-proline reductase contains selenocysteine and a pyruvoyl group that is formed from a cysteine residue by proprotein cleavage. An in vitro system to analyse proprotein cleavage of overexpressed proproteins GrdE and PrdA of the glycine- and D-proline reductase is available. Conserved amino acids located around the cleavage site of GrdE from C. sticklandii were altered and it was shown that cysteine residues located at position 242 and 246 in GrdE was involved in proprotein cleavage under in vitro conditions. Further mutations in GrdE were of minor importance in the analysed range. Experiments using truncated versions of GrdE fused to MalE and thioredoxin suggest that the cleavage domain around the cleavage site should comprise at least 30 amino acid residues for a specific and efficient in vitro cleavage. In the D-proline reductase operon the gene prdC encodes the putative electron transferring protein PrdC. The protein PrdC was partially purified from C. sticklandii. It was shown to transfer electrons derived from NADH to D-proline reductase for reduction of D-proline. To analyse the regulation of the D-proline reductase the transcription of the gene for a putative repressor protein (PrdX), a conserved σ54-dependent activator protein (PrdR), and a corresponding σ54-promotor was investigated by primer extension and RT-PCR. Experiments to establish a transformation system for C. sticklandii and E. acidaminophilum were continued to analyze mutated and fused proproteins in the wild-type background.