Untersuchungen zur gerichteten Insertion einer funktionalen Genkassette mittels CRISPR/Cas in der Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

Ziel der Arbeit war die Erweiterung von Methoden zur gezielten Modifikation des Kerngenoms der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii mithilfe der CRISPR/Cas-Technologie. Dazu kamen verschiedene DNA-Reparatur-Donore zum Einsatz, mit deren Hilfe eine vollständige, präzise sowie effiziente Insertion eines Zielgens erfolgen kann. Als Genkassette, die inseriert werden sollte, wurde eine Sequenz gewählt, die für das Enzym Aminoglycoside-3´-phosphotransferase aus Streptomyces rimosus codiert. Diese vermittelt eine Resistenz gegen Paromomycin, welche eine Selektion ermöglicht. Die Insertion wurde am SNRK2.2-Lokus vorgenommen, einer Stelle im Genom, bei dessen knock out das Enzym Arylsulfatase (Nachweis mittels Farbreaktion) unreguliert produziert wird. Die Anzahl der Klone, welche nach der Transformation eine positive Reaktion im Farbtest zeigten, wurde zur Berechnung der Transformationseffizienz verwendet. Diese Klone wurden sequenziert und mittels Southern Blot analysiert.

The aim of the work was to expand methods for the targeted modification of the nuclear genome of the green alga Chlamydomonas reinhardtii using CRISPR/Cas technology. For this purpose, various DNA repair donors were used, with the help of which a complete, precise and efficient insertion of a target gene can be achieved. A sequence coding for the enzyme aminoglycoside-3'-phosphotransferase from Streptomyces rimosus was selected as the gene cassette to be inserted. This enzyme confers resistance to paromomycin, which enables selection. The insertion was made at the SNRK2.2 locus, a site in the genome where the enzyme arylsulfatase (detection by color reaction) is produced in an unregulated manner. The number of clones that showed a positive reaction in the color test after transformation was used to calculate the transformation efficiency. These clones were sequenced and analyzed by Southern Blot.