Experimentelle und modellbasierte Studien zur Synthese und kontinuierlichen chromatographischen Aufreinigung von Galactooligosacchariden

Abstract

Die vorliegende Dissertation untersucht die enzymatische Synthese von Galactooligosacchariden (GOS) aus Lactose mit β-Galactosidase (β-Gal) sowie deren chromatographische Aufreinigung aus einem komplexen Reaktionsgemisch. Ziel der Arbeit war es, durch detaillierte experimentelle und modellbasierte Studien die zugrundeliegenden Mechanismen besser zu verstehen und die Effizienz der Prozesse zu steigern, insbesondere im Hinblick auf industrielle Anwendungen. Der erste Teil der Arbeit widmet sich der enzymatischen Synthese von GOS, wobei β-Gal aus Bacillus circulans aufgrund ihrer hohen Transgalactosylierungsleistung und Produktausbeute als optimales Enzym ausgewählt wurde. In umfangreichen experimentellen Untersuchungen wurden die Einflüsse von pH-Wert, Temperatur und Substratkonzentration auf die Reaktionskinetik und GOS-Bildung analysiert, um optimale Reaktionsbedingungen zu identifizieren. Gleichzeitig wurde der inhibierende Effekt der Nebenprodukte Glucose und Galactose auf die GOS-Ausbeute bewertet. Die mathematische Modellierung der enzymatischen Kinetik spielte eine zentrale Rolle. Mechanistische Modelle, darunter Ansätze auf Basis der Michaelis-Menten-Kinetik, Power Law und der Christiansen-Mathematik, wurden entwickelt und validiert. Ein besonderer Schwerpunkt lag auf der Berücksichtigung der Katalysatorverteilung in gekoppelten Katalysatorzyklen von Haupt- und Nebenreaktionen mittels Loop-Koeffizienten in Form eines Pseudo-Einzelkatalysezyklus, um die Bildung von GOS, Galactose und die hydrolytische Spaltung von Lactose direkt zu verknüpfen. Durch Parameterreduktion konnte die Komplexität des Modells reduziert werden, ohne die Anpassungsgenauigkeit zu beeinträchtigen, bewertet anhand des Akaike-Informationskriteriums (AIC). Ergänzend wurde eine temperaturabhängige Deaktivierungskinetik integriert, um die Dynamik des enzymatischen Aktivitätsverlustes bei höheren Temperaturen realitätsnah darzustellen. Diese Erweiterung erlaubte eine verbesserte Modellgüte, insbesondere bei der Beschreibung späterer Reaktionsphasen, und erleichterte die Vorhersage des Prozesses unter unterschiedlichen Betriebsbedingungen. Im zweiten Teil der Arbeit liegt der Fokus auf der chromatographischen Aufreinigung der GOS aus dem Multikomponentengemisch nach Reaktion. Ein spezifisch ausgewähltes PS-DVB-Harzsystem wurde als stationäre Phase eingesetzt, um die Separation von Nebenprodukten wie Glucose und Galactose sowie nicht umgesetzter Lactose zu gewährleisten. Pulschromatographische Experimente und die Untersuchung verschiedener Betriebsparameter wie Sorptionsverhalten, Temperatur und Eluentenzusammensetzung führten zur Entwicklung eines effizienten Trennverfahrens. Im hochkonzentrierten Bereich der Zucker wurde ein Anti-Langmuir-Verhalten festgestellt, das in die Optimierung der Trennbedingungen einfloss. Die Nutzung des Simulated Moving Bed (SMB)-Verfahrens, betrieben u.a. in einer konventionellen 4-Zonen-Konfiguration, ermöglichte die Fraktionierung von GOS mit nahezu 100%iger Reinheit und 98% Ausbeute. Verschiedene SMB-Betriebskonfigurationen, wie der Closed-Loop- und der 3-Zonen-Modus, wurden ebenfalls evaluiert, um Ressourceneffizienz und Produktivität weiter zu steigern. Die Kombination experimenteller Daten mit mathematischer Modellierung erwies sich dabei als effektives Werkzeug, um die Trennparameter präzise auszulegen und Prozessoptimierungen zu unterstützen. Die Arbeit beschreibt übergreifend die enzymatische Synthese und chromatographische Aufreinigung von GOS und bietet detaillierte Ergebnisse zu deren Prozessparametern, Skalierbarkeit und Optimierungsmöglichkeiten für industrielle Anwendungen.

This dissertation investigates the enzymatic synthesis of galactooligosaccharides (GOS) from lactose using β-galactosidase (β-Gal) as well as their chromatographic purification from a complex reaction mixture. The objective of the study was to gain a deeper understanding of the underlying mechanisms through detailed experimental and model-based studies and to enhance process efficiency, particularly for industrial applications. The first part of the study focuses on the enzymatic synthesis of GOS, where β-Gal from Bacillus circulans was selected as the optimal enzyme due to its high transgalactosylation efficiency and product yield. Extensive experimental investigations analyzed the effects of pH, temperature, and substrate concentration on reaction kinetics and GOS formation to identify optimal reaction conditions. Additionally, the inhibitory effects of byproducts such as glucose and galactose on GOS yield were evaluated. Mathematical modeling of enzymatic kinetics played a central role in this work. Mechanistic models, including approaches based on Michaelis-Menten kinetics, Power Law, and the Christiansen mechanism, were developed and validated. A particular focus was on the consideration of the catalyst distribution in coupled catalyst cycles of main and side reactions by means of loop coefficients in the form of a pseudo-single catalysis cycle in order to directly link the formation of GOS, galactose and the hydrolytic cleavage of lactose. Through parameter reduction, the complexity of the model could be minimized without compromising its accuracy, which was assessed using the Akaike Information Criterion (AIC). Furthermore, a temperature-dependent deactivation kinetics model was integrated to realistically depict the dynamics of enzymatic activity loss at higher temperatures. This extension improved the model's accuracy, particularly in describing later reaction phases, and facilitated process predictions under varying operational conditions. The second part of the dissertation emphasizes the chromatographic purification of GOS from the multicomponent mixture resulting from the reaction. A specifically selected PS-DVB resin system was employed as the stationary phase to separate byproducts such as glucose and galactose as well as unreacted lactose. Pulsed chromatographic experiments and the investigation of various operating parameters, such as adsorption behavior, temperature, and eluent composition, led to the development of an efficient separation process. In the high-concentration sugar range, an anti-Langmuir behavior was identified, which informed the optimization of separation conditions. The use of the Simulated Moving Bed (SMB) technique, operated in a conventional 4-zone configuration, enabled the fractionation of GOS with nearly 100% purity and 98% yield. Various SMB operating configurations, such as the Closed Loop and 3-zone modes, were also evaluated to further enhance resource efficiency and productivity. The combination of experimental data with mathematical modeling proved to be an effective tool for precisely designing separation parameters and supporting process optimization. This dissertation comprehensively describes the enzymatic synthesis and chromatographic purification of GOS, providing detailed insights into their process parameters, scalability, and optimization potential for industrial applications.