Isolierung pathogen-induzierter MAP Kinase-Signalkomplexe aus Arabidopsis thaliana

Abstract

Mitogenaktivierte Protein-Kinasen (MAPK) spielen in der Signaltransduktion und der Zellantwort auf externe Stimuli eine zentrale Rolle (Ichimura et al. 2000, Zhang et al. 2006, Tena et al. 2001). Sie sind in Netzwerken organisiert, wobei einzelne Signalkomponenten auch in verschiedenen Kaskaden eingesetzt werden können. Die Spezifität kann über die Kompartimentierung der Komponenten oder über Adapter- und Gerüstproteine erfolgen (Burack und Shaw 2000, Schwartz und Madhani 2006, Tsunoda et al. 1998). In dieser Arbeit wurden solche Kinase-Interaktionen mittels Massenspektrometrie und Tandem-Affinitätschromatographie (TAP, Rigaut et al. 1999) bzw. StrepII-Affinitätschromatographie (Witte et al. 2004) in Arabidopsis thaliana untersucht. Hauptaugenmerk lag dabei auf der Anreicherung von Proteinkomplexen der in die Pathogen-Abwehr involvierten MAP Kinasen. Hinweise auf prä-formierte MAPK Komplexe in Arabidopsis thaliana konnten bereits mittels Gelpermeations-Chromatographie für die Wildtyp und die TAP-markierten MPK3 und MPK6 erhalten werden. Die Fusionsproteine MPK3-TAP, MPK6-TAP und MPK6-strepII waren vollständig funktional. Nach flg22-Elizitierung lagen die markierten MPK3 und MPK6 phosphoryliert vor und konnten ein artifizielles Substrat in einem Aktivitäts-Assay umsetzen. Diese Daten wiesen auf eine erfolgreiche Integration der markierten MAPK in ihre physiologisch relevanten Signalkaskaden hin. Die Affinitätschromatographie erfolgte jeweils mit Blattmaterial von stabilen Pflanzen-Transformanten, da keine einsetzbaren Zellkultur-Transformanten generiert werden konnten. RuBisCO und andere abundante Kontaminanten konnten durch eine Vorfraktionierung erfolgreich abgereichert werden. Die ko-eluierten Proteine wurden anschließend in einer GeLCoder einer Shotgun-Analyse mittels 1D-nano-LC-ESI-IT-MS/MS untersucht. Neben den markierten MAPK selbst konnten weitere ko-eluierte Proteine in den Eluaten aus beiden Affinitätschromatographie-Ansätzen identifiziert werden. Dabei traten bei der StrepIIProteinreinigung mehr falsch-positive Identifizierungen auf, da weder die Einschritt-Strategie noch die damit kombinierte PEG-Vorfraktionierung ausreichend zur Abreicherung der Kontaminanten und der Anreicherung von MAPK Proteinkomplexen war. Die Ammoniumsulfat-Vorfraktionierung und Tandem-Affinitätschromatographie führte dagegen zu einer ausreichenden Anreicherung von Proteinkomplexen. Damit konnten erfolgreich einige interessante koeluierte Proteine identifiziert werden, von denen PBS1 (avrPphB suceptible1) in einer anschließenden BiFC-Analyse erste Hinweise auf eine schwache in vivo Interaktion mit der MPK3 lieferte.