Kinetische Untersuchungen humaner Sirtuin-Isoformen

Abstract

Sirtuine sind konservierte Lysin-Deacylasen, welche NAD+ als Kosubstrat verwenden. Die sieben humanen Isoformen besitzen zahlreiche Funktionen im Metabolismus, der Stressantwort und Alterungsprozessen, welches Sirtuine zu einem interessanten pharmazeutischen Ziel macht. Über die genaue Acylspezifität einzelner Sirtuin-Isoformen ist noch wenig bekannt. Für Sirt5 konnte eine Acylspezifität für Dicarbonsäuren (Succinyl, Glutaryl) ermittelt werden und, aufgrund der Acylspezifität, gelang die Entwicklung kompetitiver Sirt5-Inhibitoren. Mit SirReal2 konnte ein selektiver und hoch-affiner Inhibitor für Sirt2 entwickelt werden, welcher auch in vivo aktiv ist. Für eine genaue Charakterisierung von Sirtuin-Substraten und -Inhibitoren sind effiziente und schnelle Hochdurchsatzmessverfahren notwendig. Um dies zu gewährleisten konnten zwei kontinuierliche Fluoreszenz-basierte Assays entwickelt werden, welche beide mit einem intern Fluoreszenz-gequenchten Peptidsubstrat arbeiten.

Sirtuins are conserved lysine-deacylases using NAD+ as a cosubstrate. Sirtuins are interesting therapeutic targets due to their various functions in cellular processes like metabolism, stress response and aging. The acylspecificity of sirtuins is less discovered. Mitochondrial Sirt5 prefers dicarbonic acids (succinyl, glutaryl) and based on this acyl-specificity competitive Sirt-inhibitors could be designed. The sirtuin rearranging ligand 2 (SirReal2) is a potent and selective Sirt2-inhibitor in vitro and in vivo with a Ki-value in the nanomolar range. For kinetic characterization of substrates and inhibitors fast and efficient high throughput assays are necessary. For that reason two fluorescence-based continuous assays were developed based on internally quenched peptide substrates.