Molekül-Dynamik-Simulationen und Dockingstudien an Histon-Desacetylasen und Histon-Acetyltransferasen

Abstract

Histon-Desacetylasen (HDAC) und Histon-Acetyltransferasen (HAT) regulieren das Gleichgewicht des Acetylierungsstatus von nukleosomalen Histonen. HAT-Enzyme katalysieren die Acetylierung der ε-Aminogruppe von N-terminalen Lysinresten an Histonen, wohingegen HDAC-Enzyme die Abspaltung dieser Acetylgruppen katalysieren. Die Hemmung von HDAC-Enzymen führt zu einer Hyperacetylierung in deren Folge Apoptose oder eine Zelldifferenzierung eingeleitet werden kann. Die Hemmung von HAT-Enzymen führt zu einer Inaktivierung überaktiver HAT-Enzyme, die bei verschiedenen Krebserkrankungen eine Rolle spielen. Sowohl die Aktivität von HAT-Enzymen als auch die von HDAC-Enzymen beeinflussen Angiogenese, Zellzyklus-Arrest, Apoptose, terminale Differenzierung von unterschiedlichen Zelltypen und die Pathogenese von malignen Erkrankungen. Da die Kristallstrukturen von HDAC1 und HDAC6 noch nicht aufgeklärt waren, wurden anhand von vier veröffentlichten Kristallstrukturen (2 humanen Enzymen und 2 bakteriellen Enzymen), Homologie-Modelle für HDAC1 und HDAC6 erstellt. Die Geometrie der konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum der HDAC-Familie (Klasse 1 und Klasse 2) konnte für die Modelle übernommen werden. Validiert wurden die Homologie-Modelle anhand von Moleküldynamik-Simulationen und die geometrischen Parameter anhand von PROCHECK und PROSA überprüft. Die Kristallstrukturen und die Modelle wurden für Dockingstudien verwendet. Zu Beginn wurden verschiedene Docking- und Scoring-Parameter erprobt, um eine Methode zu finden, mit der die Posen der kokristallisierten Liganden reproduziert werden konnten. Anschließend wurde, um die Flexibilität der Seitenketten in der Bindungstasche zu berücksichtigen, ein Ensemble von unterschiedlichen Bindungstaschen (durch Rotation von Seitenketten) erzeugt. Anhand der Bindungstaschen, die die höchste Anreicherung für eine Testdatenbank mit aktiven Verbindungen zeigen konnten, wurde ein virtuelles Screening durchgeführt. Für das virtuelle Screening wurden strukturbasierte Pharmakophormodelle, die mit dem Programm LigandScout erstellt wurden, verwendet. Fünf Strukturen, die so identifiziert werden konnten, wurden für eine Testung ausgewählt. Unter den beiden aktiven Verbindungen, zeigte eine HDAC6-Selektivität. Der zweite Aspekt der Arbeit befasste sich mit der Suche nach neuen Verbindungen, die eine hemmende Wirkung für das PCAF-Enzym (ein Mitglied der GNAT-Familie) zeigen. Zu diesem Zweck wurde ein strukturbasiertes Pharmakophormodell für ein virtuelles Screening verwendet. Die über das Pharmakophor identifizierten Verbindungen wurden anschließend in die Bindungstasche der veröffentlichten Kristallstruktur von PCAF gedockt. Sieben teilweise im submikro-molaren Bereich aktive PCAF Inhibitoren wurden durch das virtuelle Screening aufgefunden.

Histone deacetylases (HDACs) and Histone acetyltransferases (HAT) mediate changes in nucleosomal conformations and are important in the regulation of gene expression. HAT enzymes catalyze the acetylation of ε-amino groups of lysine residues at the N-terminal tails of core histones. HDACs catalyze the removal of these groups. Both enzyme classes are involved in cell-cycle progression and differentiation, their deregulation is associated with several cancers. The inhibition of HDACs could cause a hyperacetylation of chromatin which results in cell-cycle arrest, differentiation or even apoptosis. The inhibition of HAT-enzymes could lead to a silencing of overactive HAT-enzymes which have been found in several cancers. Therefore HDACs and HATs have emerged as an attractive target for new anticancer drugs and there is a great demand for new inhibitors. Unfortunately the three dimensional structure of HDAC1 and HDAC6 is still unkown. However four crystal structures of isoenzymes (bacterial as well as of human origin) were recently resolved.They all reveal the structure of the binding pocket which is conserved across the HDAC-family. Based on the known X-ray structures, homology models of HDAC1 and HDAC6 were generated and validated. To analyze the stereochemical quality of model and template structures, PROCHECK and PROSA studies, as well as molecular dynamics simulations (GROMACS), were carried out. The homology models and the HDAC X-ray structure were then used for docking studies. In a first step, different docking and scoring methods were tested in order to get an appropriate tool to reproduce the experimentally derived inhibitors for HDAC8. To take into account the side-chain flexibility we generated an ensemble of different binding sites by considering different rotamers for non-conserved amino acids within the binding pocket. The binding sites which showed high enrichment for a testset of known HDAC inhibitors were selected and used for virtual database screening. The virtual screening was carried out using structure based pharmacophor models generated by the program LigandScout. Five compounds were detected through the virtual screening were tested for HDAC inhibitory activity. Two active compounds including one HDAC6-selective compound were identified. A second aspect was to search for new inhibitors of PCAF-enzymes (a member of the GNAT-familiy). For this purpose a pharmacophormodel was used for virtual screening. Selected compounds were then used for docking into the recently published crystal structure of the PCAF-enzyme. Seven active hits could be identified which inhibit PCAF in the micro-molar range.