Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/2492
Title: Struktur-Funktionsuntersuchungen von humaner Dipeptidylpeptidase IV und Prolylendopeptidase in Bezug auf die Hydrolyse von artifiziellen und physiologischen Substraten
Author(s): Bär, Joachim Wolfgang
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2005
Extent: Online-Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Type: PhDThesis
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000009430
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Online-Publikation
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Die multifunktionelle Serinprotease Dipeptidylpeptidase IV/CD26 (DP IV) ist in der Lage Dipeptide vom N-Terminus von Peptiden abzuspalten und diese damit in ihrer Funktion zu aktivieren oder zu deaktivieren. Inhalt der vorliegenden Arbeit waren Untersuchungen von Struktur- und Funktionsbeziehungen mit humaner DP IV bezüglich der Hydrolyse von höher- und niedermolekularen Substraten bzw. Inhibitoren nach Etablierung und Optimierung einer Expressions- und Isolierungsstrategie zur Herstellung des rekombinanten Enzyms. Durch die in dieser Arbeit optimierte Expression und Isolierung der rekombinanten humanen DP IV (rhDP IV) ist es möglich Inhibitoren und Substrate innerhalb der Firma probiodrug AG anhand des humanen Enzyms zu charakterisieren. Die biochemischen und kinetischen Eigenschaften der rhDP IV wurden mit denen der ssDP IV verglichen. Der Einfluss der Aminosäuren R125, E205, E206, Y547, W629, Y631 und N710 auf diese Wechselwirkungen wurde mit Hilfe von Mutationsstudien untersucht. Im Ergebnis der Untersuchungen konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit dipeptidanalogen Substraten bzw. Inhibitoren gemessenen Daten nicht direkt auf die Hydrolyse von physiologischen Substraten übertragbar sind. Die ASminosäuren N710 und R125 sind insbesondere zur Hydrolyse von längeren Peptidsubstraten notwendig, wenn sich Alanin oder Serin in P1-Position befinden. Damit wurde erstmalig gezeigt, dass bei der Bindung und Hydrolyse von Peptiden, die kein Prolin in P1-Position aufweisen, die Interaktion der Aminosäuren R125 und N710 mit dem Peptidrückgrat des Substrates eine entscheidende Rolle spielen. Weitere Ergebnisse zeigen, dass der P1-Position eine unterschiedliche Bedeutung bei der Hydrolyse von höher- und niedermolekularen Substraten zukommt. Im Ergebnis gelang es mit dem Hexapeptid TFTSDY, abgeleitet von dem innerhalb der GRF/Glukagon-Peptidfamilie hoch homologen Bereich der Aminosäuren 5-10, erstmals substratspezifisch die Hydrolyse von Glukagon und GIP (Peptide der GRF/Glukagon-Familie) um den Faktor 13 (für Glukagon) bzw. 20 (für GIP) zu verlangsamen. Im Gegensatz dazu war die Umsatzgeschwindigkeit des Chemokins RANTES(1-15) durch das Peptid TFTSDY nicht beeinträchtigt. Mit diesem neuen potentiellen Inhibitor ist es somit zum ersten Mal möglich, gezielt zwischen einzelnen Peptidsubstraten zu unterscheiden. Im Verlauf der Charakterisierungsstudien wurde die DP IV katalysierte Hydrolyse eines bis dahin in der Literatur als resistent gegenüber DP IV beschriebenen Substrates, Pancreatic Polypeptid gezeigt. Mit der in dieser Arbeit exprimierten rhDP IV war es möglich erfolgreich Proteinkristalle zu erzeugen und ein Datensatz mit einer Auflösung von 2,08 Å aufzunehmen. Es konnte nachgewiesen werden, dass das aus 24 Aminosäuren bestehende Peptid Humanin (HN) ein Substrat der intrazellulär vorkommenden PEP darstellt. Neben einer post-Prolin(3) Prozessierung wurde auch erstmals eine Hydrolyse am C-Terminus von Cystein(8) nachgewiesen. Die bisher unbekannte Substratspezifität gegenüber Cystein in P1-Position konnte auch erstmals für DP IV, nach dem Austausch von Alanin gegen Cystein an vorletzter Position von GIP (A2C-GIP), nachgewiesen werden.
Dipeptidyl peptidase IV/CD26 (DP IV) is a multifunctional serine protease hydrolyzing the release of dipeptides from the N-terminus of oligopeptides and small polypeptides. The proline specific enzyme can either inactivate or activate by its catalytic action, a variety of peptides. This work deals with structural and functional relation studies of DP IV regarding its hydrolytic action on substrates (physiological substrates and dipeptide derivatives) and inhibitor binding after previously establishing and optimizing the expression and purification of human recombinant DP IV. Human DP IV was expressed in Pichia pastoris in a fermentation set up, purified to homogeneity and characterized. In the future, the optimized expression and purification procedure will allow kinetic characterization studies of inhibitors and substrates to be performed with human recombinant DP IV. In order to elucidate the function and the contribution of single amino acids, such as R125, E205, E206, Y547, W629, Y631 and N710, which surround the catalytic triad of DP IV, their specific role was investigated by carrying out mutagenesis studies. It was shown, that the kinetics found with synthetic dipeptide derivatives was not the same as that observed with physiological substrates. The amino acid N710 and R125 play an essential role in the binding and hydrolysis of long natural substrates with alanine (GIP) or serine (PACAP38) in the P1-position while substrates with proline in this position are not dependent on the amino acids R125 and N710. Based on the findings that a certain chain length is necessary to stabilize peptide binding, possible inhibition of these "secondary" interactions was investigated. A new class of inhibitor directed against "secondary" interactions between enzyme and substrate was generated which allows for the first time to distinguish between substrate families avoiding putative severe side effects in therapy, based on the inhibition of DP IV catalysis. During the characterization studies, it was demonstrated, that the pancreatic polypeptide (36 amino acids of length, proline in the P1-position), a member of the pancreatic polypeptide family, is a substrate of DP IV. A dataset with a resolution of 2.08 Å was obtained from protein crystal analysis by X-Ray Diffraction experiments with human recombinant DP IV. It could be demonstrated, that Humanin (HN) (consists of 24 amino acids), a recently described intracellular located peptide with a protective effect against Bax induced cell death, is processed by PEP. In addition, unexpected post-cysteine(8) specific hydrolysation of HN was observed. The previously undiscovered specificity for a post-cysteine cleavage was also demonstrated with DP IV, by processing the GIP variant A2C-GIP after the cysteine residue.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/9277
http://dx.doi.org/10.25673/2492
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License: In CopyrightIn Copyright
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