In-depth characterization and cell culture-based production in influenza A virus defective interfering particles

Abstract

Infections with the highly contagious influenza A virus (IAV) cause a significant disease and economic burden. Annual influenza vaccination is the best prevention of the influenza disease. However, vaccination and antiviral therapy are limited by emerging viral resistance. A promising antiviral modality are defective interfering particles (DIPs) of IAV that are considered to be safe, effective and broadly-acting. Conventional DIPs (cDIPs) harbor a large internal deletion in one of the eight viral RNA (vRNA) segments of IAV and are replication-deficient. Upon co-infection with infectious standard virus (STV), the missing protein is provided and DIPs can propagate. In a co-infection scenario, DIPs suppress the spread of STVs. A cell culture-based process for production of purely clonal cDIPs in the absence of STVs is available by complementing the genetic defect in trans by genetically modified Madin-Darby canine kidney (MDCK) suspension cells. This development eliminated safety and regulatory concerns of previous DIP preparations that required the use of STV and subsequent UV inactivation. Recently, the IAV DIP “OP7” was discovered, which has multiple point mutations within segment (Seg) 7 of its vRNA and exhibited superior antiviral activity compared to cDIPs. Yet, cell culture-based OP7 production is still dependent on co infection with STVs. In the first publication, an IAV DIP evolution study was performed to select highly interfering natural DIP isolates and to investigate de novo generation and propagation competition between DIPs. A small-scale two-stage cultivation system allowed for long-term STV and DIP propagation. Data obtained from next-generation sequencing demonstrated that the most competitive defective interfering (DI) vRNAs occur on the polymerase-encoding segments (Seg 1–3). Moreover, DI vRNAs comprised a short, but optimal length for replication. During long-term propagation, distinct DI vRNAs accumulated to high fractions towards the end of cultivation, while others decreased. DIPs harboring these highly abundant DI vRNAs showed a superior interfering efficacy relative to known IAV cDIPs and could be very promising candidates for antiviral therapy. The second manuscript describes the investigation of the replication dynamics on intracellular and cell population level for a broad range of infection regimes of DIPs and STVs using suspension cells. A high load of DIPs at low STVs input could prevent virus-induced cell death and shut down STV propagation. The data was used by a collaborating partner for establishment and validation of a mathematical multiscale model of IAV STV and DIP infection, which enabled the prediction of an optimal DIP dosing ratio. In the third publication, the broad-spectrum antiviral activity of IAV DIPs was assessed in vitro. Co-infection experiments in human lung cells (A549) revealed that IAV DIPs suppress the replication of respiratory syncytial, yellow fever, and Zika virus. The antiviral effect depended on innate immunity, more specifically, the Janus kinase/signal transducers and activators of transcription (JAK/STAT) signaling pathway. Results suggested that IAV DIPs are broadly-acting antiviral agents that might also be used to combat interferon (IFN)-sensitive virus infections, especially of respiratory viruses. Further, a cell culture-based production system for OP7 chimera DIPs free of STVs was investigated. A mixture of OP7 chimera DIPs and cDIPs was generated by reverse genetics by a collaborating partner and used as DIP seed. Multiplicity of infection (MOI) had a strong effect on virus titers, fraction of OP7 chimera DIPs, and interfering efficacy (efficacy of DIPs to inhibit STV propagation in vitro or in vivo) for production in genetically engineered suspension cells in shake flasks. Production at an optimal MOI of 10-3 and 10-4 resulted in maximum interfering efficacies, yet, only relatively low virus titers were achieved and only a part of the DIP harvest was OP7 chimera DIPs (78.7% and 38.3%, respectively). In addition, OP7 chimera DIP material was tested in mice carried out by collaborating partners. OP7 chimera DIP material exhibited a high tolerability and antiviral efficacy in vivo. Next, a scalable cell culture-based production process for OP7 chimera DIPs free of STVs was developed. A temperature decrease from 37°C to 32°C for virus production resulted in the presence of almost pure OP7 chimera DIPs preparations (99.7%) and an 11-fold higher total virus yields relative to the initial process. In addition, subsequent process intensification by perfusion cultivation applying an alternating tangential flow filtration (ATF) system with perfusion rate control allowed for up to a 79-fold increase in total virus yields relative to the initial batch-process in shake flasks. However, only a subset of virus particles (26%) was able to pass through the hollow fiber membrane (0.2 μm pore size, polyethersulfone). Continuous virus harvesting would enable direct virus harvest cooling, thus, increasing virus stability and virus yields. Hence, a proof-of-concept study was carried out to test a tangential flow depth filtration (TFDF) system (pore size 2–5 μm) as a novel cell retention system for intensification of virus production. Recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV)-based constructs were used as a virus test model. The TFDF system did not only allow for high cell retention efficiencies and cultivations at high viable cell concentrations, but also for continuous virus harvesting and clarification in a single-step. Taken together, results obtained clearly demonstrated that the development of a safe, highly effective and broadly-acting IAV DIP treatment against respiratory virus infections should be feasible. A production process under good manufacturing practice (GMP), based on the process platform established in this thesis, is currently under development to initiate (pre-) clinical trials.

Infektionen mit dem hochansteckenden Influenza-A-Virus (IAV) verursachen erhebliche gesundheitliche und wirtschaftliche Belastungen. Die beste Vorbeugung gegen die Grippe stellt die jährliche Grippeimpfung dar. Allerdings sind der Impfung und antiviralen Therapien durch aufkommende Resistenzen im (genetischen Code des) Virus Grenzen gesetzt. Ein vielversprechendes antivirales Therapeutikum sind vom IAV abstammende defekte interferierende Partikel (DIPs), die als sicher, wirksam und breit wirkend gelten. Konventionelle DIPs (cDIPs) weisen eine große interne Deletion in einem der acht viralen RNA-Segmente (vRNA) von IAV auf und sind nicht replikationsfähig. Bei einer Koinfektion mit dem infektiösen Standardvirus (STV) wird das fehlende Protein bereitgestellt und DIPs können sich vermehren. In einem Koinfektionsszenario unterdrücken DIPs die Ausbreitung von STVs. Ein zellkulturbasiertes Verfahren zur Herstellung rein klonierter cDIPs in Abwesenheit von STVs wurde dadurch ermöglicht, dass der genetische Defekt in trans durch genetisch veränderte Madin-Darby canine kidney (MDCK)-Suspensionszellen ergänzt wird. Durch diese Entwicklung konnten die Sicherheits- und Zulassungsbedenken früherer DIP-Präparate, die den Einsatz von STV und eine anschließende UV-Inaktivierung erforderten, ausgeräumt werden. Vor kurzem wurde das IAV-DIP "OP7" entdeckt, das mehrere Punktmutationen im Segment (Seg) 7 seiner vRNA aufweist und im Vergleich zu cDIPs eine höhere antivirale Aktivität zeigte. Die Produktion von OP7 in Zellkulturen ist jedoch nach wie vor von der Koinfektion mit STV abhängig. In der ersten Veröffentlichung wurde eine IAV-DIP-Evolutionsstudie durchgeführt, um stark interferierende natürliche DIP-Isolate zu selektieren und die de novo Generation und den Vermehrungswettbewerb zwischen DIPs zu untersuchen. Ein zweistufiges Kultivierungssystem im kleinen Maßstab ermöglichte die langfristige Vermehrung von STVs und DIPs. Daten aus Next generation sequencing zeigten, dass die wettbewerbsfähigsten defekten interferierenden (DI) vRNAs auf den Polymerase kodierenden Segmenten (Seg 1-3) auftreten. Darüber hinaus wiesen DI vRNAs eine kurze, aber optimale Länge für die Replikation auf. Während der Langzeitvermehrung reicherten sich bestimmte DI vRNAs bis zum Ende der Kultivierung zu hohen Anteilen an, während andere abnahmen. DIPs, die diese äußerst häufigen DI vRNAs enthielten, zeigten im Vergleich zu bereits bekannten IAV-cDIPs eine erhöhte interferierende Wirksamkeit und könnten vielversprechende Kandidaten für eine antivirale Therapie sein. Das zweite Manuskript beschreibt die Untersuchung der Replikationsdynamik auf intrazellulärer Ebene und auf Ebene der Zellpopulationen für ein breites Spektrum von Infektionsregimen von DIPs und STVs unter Verwendung von Suspensionszellen. Eine hohe DIP-Konzentration bei geringer STV-Konzentration konnte den virusinduzierten Zelltod verhindern und die Vermehrung von STVs unterbinden. Die Daten wurden von einem Kooperationspartner zur Entwicklung und Validierung eines mathematischen Multiskalenmodells der IAV-STV- und DIP-Infektion verwendet, welches die Vorhersage eines optimalen DIP-Dosierungsverhältnisses ermöglichte. In der dritten Veröffentlichung wurde die antivirale Breitbandaktivität von IAV-DIPs in vitro untersucht. Koinfektionsexperimente in menschlichen Lungenzellen (A549) zeigten, dass IAV-DIPs die Replikation vom Respiratorischen Synzytial-Virus, Gelbfiebervirus und Zika-Virus unterdrücken. Die antivirale Wirkung hing von der angeborenen Immunität ab, genauer gesagt vom Janus kinase/signal transducers and activators of transcription (JAK/STAT)-Signalweg. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass IAV-DIPs breit wirkende antivirale Wirkstoffe sind, die auch zur Bekämpfung von anderen Interferon (IFN)-empfindlichen Virusinfektionen, insbesondere von Atemwegsviren, eingesetzt werden könnten. Darüber hinaus wurde ein zellkulturbasiertes Produktionssystem für OP7-Chimären DIPs ohne STVs untersucht. Eine Mischung aus OP7-Chimären-DIPs und cDIPs wurde von einem Kooperationspartner durch reverse Genetik erzeugt und als DIP Saatgut verwendet. Die Multiplizität der Infektion (MOI) hatte einen starken Einfluss auf die Virustiter, den Anteil der OP7-Chimären-DIPs und die interferierende Wirksamkeit (Wirksamkeit der DIPs zur Unterdrückung der STV-Replikation in vitro oder in vivo) bei der Produktion in genetisch veränderten Suspensionszellen in Schüttelkolben. Die Produktion bei einer optimalen MOI von 10-3 und 10-4 führte zu einer maximalen interferierenden Wirksamkeit, wobei jedoch nur relativ niedrige Virustiter erreicht wurden und nur ein Teil der DIP-Ernte OP7-Chimären-DIPs waren (78,7 % bzw. 38,3 %). Darüber hinaus wurde Material von OP7-Chimären-DIPs in Mäusen von Kooperationspartnern getestet. Das Material von OP7-Chimeren-DIPs zeigte eine hohe Verträglichkeit und antivirale Wirksamkeit in vivo. Anschließend wurde ein skalierbarer zellkulturbasierter Produktionsprozess für STV freie OP7-Chimäre-DIPs entwickelt. Eine Temperatursenkung von 37°C auf 32°C für die Virusproduktion führte zu nahezu reinem Material an OP7-Chimerären-DIPs(99,7 %) und zu einer 11-fachen Steigerung der Gesamtvirusausbeute im Vergleich zum ursprünglichen Prozess. Die anschließende Intensivierung des Prozesses durch Perfusionskultivierung unter Verwendung eines alternierenden Tangentialflussfiltrationssystems (ATF) mit Regelung der Perfusionsrate ermöglichte eine bis zu 79-fache Steigerung der Gesamtausbeute an Viren im Vergleich zum ursprünglichen Batch-Prozess in Schüttelkolben. Allerdings konnte nur eine Teilmenge der Viruspartikel (26 %) die Hohlfasermembran (0,2 μm Porengröße, Polyethersulfon) passieren. Eine kontinuierliche Virusernte würde eine direkte Kühlung der Virusernte ermöglichen und damit die Stabilität der Viren und die Virusausbeute erhöhen. Daher wurde eine Machbarkeitsstudie durchgeführt, um ein Tangentialfluss-Tiefenfiltrationssystem (TFDF) (Porengröße 2-5 μm) als neuartiges Zellrückhaltesystem zur Intensivierung der Virusproduktion zu testen. Als Virustestmodell wurden rekombinante Konstrukte auf Basis des vesikulären Stomatitis-Virus (rVSV) verwendet. Das TFDF-System ermöglichte nicht nur hohe Zellrückhalteeffizienzen und Kultivierungen bei hohen Lebendzellkonzentrationen, sondern auch eine kontinuierliche Virusernte und Aufreinigung in einem einzigen Schritt. Insgesamt zeigten die Ergebnisse deutlich, dass die Entwicklung einer sicheren, hochwirksamen und breit wirkenden IAV-DIP-Behandlung gegen Virusinfektionen der Atemwege machbar sein sollte. Ein Produktionsprozess unter guter Herstellungspraxis (GMP), der auf der in dieser Arbeit etablierten Prozessplattform basiert, wird derzeit entwickelt, um (prä-)klinische Studien zu initiieren.