Production of a fusogenic oncolytic virus : In-depth process development and process intensification

Abstract

Oncolytic virotherapy is an elegant approach to cancer therapy, leveraging viruses to selectively infect and destroy cancer cells, sparing healthy tissues. While the oncolytic virus (OV) directly targets the tumor, effectiveness is further enhanced by simultaneous stimulation of the body's immune system with an anti-tumor response. This strategy offers hope for treating otherwise untreatable types of cancer. However, often highly concentrated dose inputs in the range of 108-1011 infectious virions/injection are required to achieve a therapeutic effect and delivery to tumor sites. Therefore, development of robust OV production processes are crucial to generate highly concentrated virus inoculum. Various OV platforms currently under investigation rely on anchorage- dependent cell types due to their historical use in commercial viral vaccine production. However, the use of adherent cell cultures has multiple drawbacks, including low virus yields, increased batch variation, and limited scalability, especially for fusogenic OVs that cause syncytia formation and bystander cell death. Alternatively, the use of suspension cell lines may be more advantageous, but the low availability of GMP-compliant continuous suspension cells further complicates the development of commercially viable products for virotherapy. To overcome these challenges, the project aimed to (i) identify suitable substrates that allowed for rapid growth and high virus titers in a tightly controlled production system, and (ii) establish transferable batch and perfusion processes for large- scale production of a novel fusogenic OV. A broad range of suspension cell lines were screened to develop a highly efficient and scalable batch production process for a novel hyper-fusogenic hybrid of vesicular stomatitis virus and Newcastle disease virus (rVSV-NDV). Small-scale cultivations (1550 mL) were used to optimize critical upstream processing parameters (multiplicity of infection (MOI), temperature, pH, adaptation, aggregation) for four promising cell substrates (AGE1.CR.pIX, BHK-21, HEK293, CCX.E10). Not only the cell line, but also the culture medium played a pivotal role for the peak virus titer and the stability of virus particles in the supernatant. The identification of an optimal MOI for each cell line was critical to achieve high infectious virus titers, while increased cell-to-cell contact had no detectable effect on rVSV-NDV yield. Virus adaptations resulted in similar virus yields, however onset of virus release was drastically reduced. Best conditions were transferred to 1 L and 3 L stirred tank bioreactors (STR) or 10 L orbitally shaken bioreactors, resulting in a 100-fold increase in virus yield (up to 4.2x108 TCID50/mL), when compared to production in adherent cell cultures without loss of oncolytic potency. Next, process intensification methods were evaluated by increasing cell concentrations in perfusion mode. Initial optimization studies focusing on MOI, viable cell concentration (VCC) at time of infection, media, and usage of supplements were carried out in shake flasks using a high cell density (HCD) semi-perfusion strategy. Improved virus titers (43-56-fold), cell-specific virus yields (CSVY) (5-28-fold), and volumetric virus productivities (VVP) (6-18-fold) were observed after infection at >20x106 cells/mL. Subsequently, continuous perfusion processes were implemented using an acoustic settler or membranes as cell retention devices (CRDs) coupled to bioreactors. Depending on the cell substrate, VCCs up to 15.0-45.9x106 cells/mL and rVSV-NDV titers of up to 7.1x109 TCID50/mL (>1,000-fold increase compared to production in adherent cultures) were achieved without loss of oncolytic potency. CSVYs obtained for these HCD cultivations were up to 2-fold higher compared to batch cultivations, resulting in space- time-yield (STY) increases of >460% and comparable VVPs. Modification of a traditional membrane-based ATF set-up by utilization of a hollow-fiber membrane with a large internal lumen (0.75 mm) combined with a high flow rate (1.5 L/min) hampered syncytia formation and prevented complete blockage. However, rVSV-NDV was retained by the membrane (>97% at 18 h post infection). Transition to tangential flow depth filtration (TFDF) perfusion allowed continuous virus harvesting and clarification with a high reduction of solution turbidity (>95%), despite the fusogenic OV causing large multi- nucleated syncytia. Implementation of this novel, closed, single-use perfusion system substantially simplified process operations and constitutes a cornerstone for integrated, sustainable and economical OV production up to 2000 L. Taken together, this work paves the way for the establishment of an efficient large-scale manufacturing process, in either batch or perfusion mode that provides sufficient amounts of highly potent virus material to allow for phase I clinical trials in cancer patients.

Die Entwicklung effizienter Produktionsverfahren für onkolytische Viren (OV) spielt eine entscheidende Rolle für die klinische Anwendung und den Erfolg der Virotherapie. Obwohl derzeit viele verschiedene OV-Plattformen untersucht werden, basiert die Herstellung solcher Viren hauptsächlich auf adhärenten Zellkulturen, die viele Herausforderungen mit sich bringen. Bevor eine Produktion im Industriemaßstab in Betracht gezogen bzw. optimiert werden kann, muss zuerst ein Zellsubstrat identifiziert werden, welches ein schnelles Zellwachstum und eine hohe Virusausbeute in einem stringent kontrollierten Produktionssystem ermöglicht. Allerdings sind GMP-konforme kontinuierliche Suspensionszelllinien nur begrenzt verfügbar, was die Entwicklung kommerziell nutzbarer Produkte weiter erschwert. In dieser Arbeit wurden sämtliche Hürden auf dem Weg zu einem optimierten Batch- und Perfusionsprozesse chronologisch betrachtet, um schließlich die effiziente Produktion eines fusogenen OV in verschiedenen Kultivierungssysteme zu etablieren. Im ersten Teil dieses Projekts wurde ein breites Spektrum von Suspensionszelllinien verschiedener Wirtsspezies untersucht, um ein effizientes und skalierbares Batch- Produktionsverfahren für ein neuartiges hyperfusogenes Hybrid-Virus aus vesikulären Stomatitis und dem Newcastle Disease Virus (rVSV-NDV) zu entwickeln. Kultivierungen im kleinen Maßstab (15-50 ml) wurden zur Optimierung kritischer Upstream- Prozessparameter (Multiplizität der Infektion (MOI), Temperatur, pH-Wert, Virus- Adaptation, Zellaggregation) für vier vielversprechende Zellsubstrate (AGE1.CR.pIX, BHK-21, HEK293, CCX.E10) verwendet. Nicht nur die Zelllinie, sondern auch das Kulturmedium spielte eine entscheidende Rolle für hohe Virustiter und die Stabilität der Viruspartikel im Überstand. Die Identifizierung einer optimalen MOI für jede Zelllinie war entscheidend, um hohe infektiöse Virustiter zu erreichen, während ein erhöhter Zell-zu- Zell-Kontakt keine nachweisbaren Auswirkungen auf die rVSV-NDV-Ausbeute hatte. Virusadaptierungen führten zu ähnlichen Virusausbeuten, jedoch wurde der Beginn der Virusfreisetzung beschleunigt. Die besten Bedingungen wurden in 1 L und 3 L Rührbioreaktoren oder 10 L geschüttelte Bioreaktoren übertragen. Damit wurde eine 100-fache Steigerung des Virustiters (bis zu 4,2x108 TCID50/ml) im Vergleich zur Produktion in adhärenten Zellkulturen ohne Beeinträchtigung der onkolytischer Potenz erreicht. Als nächstes wurden Methoden zur Prozessintensivierung durch Erhöhung der Zellkonzentrationen im Perfusionsmodus evaluiert. Erste Optimierungsstudien, die sich auf die MOI, die Lebendzellkonzentration (VCC) zum Zeitpunkt der Infektion, Medien und die Verwendung von Zusätzen konzentrierten, wurden in Schüttelkolben unter Verwendung einer Semi-Perfusionsstrategie mit hoher Zelldichte (HCD) durchgeführt. Nach der Infektion mit >20x106 Zellen/mL wurden verbesserte Virustiter (43- bis 56-fach), zellspezifische Virusausbeuten (CSVY) (5-28-fach) und volumetrische Virusproduktivitäten (VVP) (6-18-fach) beobachtet. Anschließend wurden kontinuierliche Perfusionsprozesse unter Verwendung eines akustischen Filters oder von Membranen als Zellrückhaltevorrichtungen (CRDs), die an Bioreaktoren gekoppelt sind, implementiert. Je nach Zellsubstrat wurden Konzentrationen von bis zu 15,0-45,9x106 Zellen/ml und rVSV-NDV-Ausbeuten von bis zu 7,1x109 TCID50/ml (>1.000-fache Steigerung im Vergleich zu adhärenten Zellkulturen) ohne Verlust der onkolytischen Potenz erreicht. Die zellspezifischen Virusausbeuten, die bei diesen HCD-Kulturen erzielt wurden, waren im Vergleich zu früheren Batch-Kulturen bis zu 2-mal höher, was zu Raum-Zeit-Ausbeutesteigerungen von >460% und vergleichbaren volumetrischen Virusproduktivitäten führte. Die Modifizierung eines herkömmlichen membranbasierten ATF-Aufbaus durch Verwendung einer Hohlfasermembran-Membran mit einem großen internem Durchmesser (0,75 mm) in Kombination mit einer hohen Durchflussrate (1,5 L/min) beeinträchtigte die Synzytienbildung und verhinderte eine vollständige Blockierung der Membran. Allerdings wurde rVSV-NDV von der Membran zurückgehalten (>97 % bei 18 h nach Infektion). Der Übergang zur TFDF-Perfusion ermöglichte eine kontinuierliche Virusernte und Klärung mit einer starken Verringerung der Trübung der Lösung (>95 %), obwohl das fusogene rVSV-NDV die Ausbildung großer Synzytien verursachte. Die Implementierung dieses neuartigen, geschlossenen Einweg-Perfusionssystems vereinfacht die Prozessabläufe erheblich und bildet einen Grundstein für künftige Entwicklungen in Richtung integrierter, nachhaltiger und wirtschaftlicher Prozesse bis zum 2000-Liter-Maßstab.