Modeling the dynamics of cell growth, central carbon metabolism and virus production in animal cells

Abstract

Cell culture processes are a well-established platform for the research and manufacture of therapeutic biologicals such as recombinant proteins and vaccines. Cell growth and production of these products requires optimal cultivation conditions (temperature, pH value, dissolved oxygen, etc.) and a well formulated medium (substrates or energy sources, amino acids, vitamins, and micro-nutrients). Growing cells can adjust the substrates usage and products release via reactions of the metabolic network (comprising transmembrane transporters and enzymes) to produce energy and precursors. Furthermore, it is also known that enzymes are controlled using sophisticated regulation mechanisms. Thus, increasing the cell growth and by-product yields requires the understanding of cellular metabolism, especially the central carbon metabolism where most of the energy and precursors are produced. Relatively few dynamic mathematical models have been developed that describe cell growth and the central carbon metabolism, especially for animal cell lines due to a lack of experimental data and complexity of this system. Most modeling approaches focus on cell growth and extracellular metabolites, while some include only parts of the central carbon metabolism (intracellular), limiting their applicability. The overall focus of this work was the development of quantitative and dynamic mechanistic models that describe both cell growth and central carbon metabolism which are observed at different scales, i.e., the macroscopic scale (bioreactor) and microscopic scale (intracellular). For the macroscopic scale, a segregated cell growth model that describes substrates, by-products as well as cell number and cell volume was established. For the microscopic scale, a structured model of the central carbon metabolism was developed. Both models were coupled, allowing a direct connection between cell growth, substrates consumption, metabolic by-product release and the intracellular state. The central carbon metabolism describes the dynamics of key metabolites from glycolysis, the citric acid cycle, glutaminolysis, transamination, and the pentose phosphate pathway. The first aim of this work was to establish a dynamic mathematical model for the human designer cell line AGE1.HN.AAT (provided by ProBioGen AG, Germany). The model comprises a set of 33 ordinary differential equations (ODEs) accounting for cell growth (concentration of viable cells, mean cell diameter, volume of viable cells), and the concentration of key substrates and metabolites both at the intracellular and extracellular level. It also describes the formation of the product alpha1-antitrypsin. Model validity was assessed using experimental data of four independent batch cultivations performed at different scales (0.5 and 2.5 L) in a chemically defined medium. Using the same set of parameters and specific initial conditions for each experiment, the model simulations captured the concentration dynamics in the four experiments well. Analysis of the simulated intracellular rates revealed at least two distinct cellular physiological states. The first cellular physiological state was characterized by a high glycolytic rate and high lactate production. Conversely, the second state was characterized by efficient ATP production, a low glycolytic rate, and reactions of the TCA cycle (tricarboxylic acid cycle) running in the reverse direction from alpha-ketoglutarate to citrate. The model was used to predict the impact of changes of media composition and maximum enzyme activity on the intracellular metabolism. Finally, based on the knowledge from this work, options for improving cell growth and measures towards the establishment of a more efficient metabolism were addressed. The second aim of this work was the establishment of a dynamic mathematical model to describe cell growth, the central carbon metabolism and influenza A virus (IAV) production in suspension Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. This model structure was based on the previously established model for a human designer cell line (AGE1.HN.AAT, first aim of this work) and takes additional aspects related to IAV propagation into account. The model is composed of 35 ODEs that account for cell growth, the concentrations of key metabolites and virus production (virus titer). Most model parameters were estimated using experimental data from a mock-infected cell culture. Using the set of identified parameters and specific initial conditions for each experiment, model simulations accurately captured the overall dynamics of the mock- infected culture and could largely predict the dynamics of cultivations with infected cells. For the first 24 hours post infection (hpi), IAV infection appeared to have a negligible effect on the intracellular metabolism, with most of changes in metabolic rates occurring as a direct result of cell growth arrest, virus-induced apoptosis, cell damage and cell lysis. A few notable exceptions were the dynamics of glutamate and ammonium release at later infection time points (>24 hpi). Based on the model simulations with a unique set of parameters largely capturing the dynamics of non-infected and infected cells, it was concluded that IAV infection has only a minor impact on central carbon and energy metabolism of MDCK suspension cells. Most metabolic changes could be directly explained by accounting for the cessation of cell growth during virus infection and the subsequent transition to apoptosis and cell death. Additional in silico studies were conducted to investigate the cause of the discrepancy between experimental data and model simulations for glutamate and ammonium during late infection phases. The results indicated that the discrepancy could be attributed to the degradation of amino acid by enzymes in the bioreactor induced by cell lysis in the late phase of infection. Overall, this work showed that cell growth, intracellular metabolism, and extracellular by- product accumulation can be described closely with a relatively simple model (few parameters, <150), when the corresponding experimental data is available. Furthermore, model simulations enabled the identification of unique metabolic states and elucidated the transition between Warburg effect (inefficient glycolysis) and more efficient metabolism (low glycolysis, lactate consumption and active TCA). It was shown that such a model may be used for media design, which is highly desirable in a pharmaceutical industry setting, and provides a solid tool to identify changes in metabolism during virus infection.

Zellkulturverfahren sind eine gut etablierte Plattform für die Erforschung und Herstellung therapeutischer Arzneimittel, wie z.B. rekombinante Proteine und Impfstoffe. Das Zellwachstum und die Herstellung dieser Produkte erfordern optimale Kultivierungsbedingungen (Temperatur, pH-Wert, gelöster Sauerstoff, usw.) und ein gut formuliertes Medium (Substrate oder Energiequellen, Aminosäuren, Vitamine und Mikronährstoffe). Wachsende Zellen können von der Anpassung des Substratverbrauchs und der Produktfreisetzung durch Reaktionen ihres metabolischen Netzwerks (Kombination aller Transmembrantransporter und Enzyme) profitieren. Darüber hinaus werden diese Enzyme durch ausgeklügelte Regulationsmechanismen gesteuert. Die Steigerung des Zellwachstums und der Nebenproduktausbeute erfordert daher ein Verständnis des zellulären Stoffwechsels, insbesondere des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels, in dem der größte Teil der Energie und der Vorläuferstoffe produziert wird. Aufgrund des Mangels an experimentellen Daten und der inhärenten Komplexität solcher Systeme wurden bisher nur wenige dynamische mathematische Modelle zur Beschreibung des Zellwachstums und des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels entwickelt, insbesondere für tierische Zelllinien. Die meisten Modellierungsansätze konzentrieren sich auf das Zellwachstum und extrazelluläre Metabolite, während einige nur Teile des (intrazellulären) zentralen Kohlenstoffstoffwechsels berücksichtigen, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung quantitativer und dynamischer mechanistischer Modelle, die sowohl das Zellwachstum als auch den zentralen Kohlenstoffstoffwechsel beschreiben, die auf verschiedenen Skalen beobachtet werden, d. h. auf der makroskopischen Skala (Bioreaktor) und der mikroskopischen Skala (zelluläres Zytoplasma, intrazellulär). Für den makroskopischen Maßstab wurde ein segregiertes Zellwachstumsmodell erstellt, das Substrate, Nebenprodukte sowie Zellzahl und -volumen beschreibt. Für die mikroskopische Skala wurde ein strukturiertes Modell des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels entwickelt. Beide Modelle wurden gekoppelt, so dass eine direkte Verbindung zwischen Zellwachstum, Substratverbrauch, Freisetzung von Stoffwechselnebenprodukten und dem intrazellulären Zustand hergestellt werden konnte. Der zentrale Kohlenstoffstoffwechsel beschreibt die wichtigsten Metaboliten aus der Glykolyse, dem Zitronensäurezyklus, der Glutaminolyse, der Transaminierung und dem Pentosephosphatweg. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines solchen dynamischen mathematischen Modells für die menschliche Designer-Zelllinie AGE1.HN.AAT (zur Verfügung gestellt von ProBioGen AG, Deutschland). Das Modell umfasst 33 gewöhnliche Differentialgleichungen, die das Zellwachstum (Konzentration lebensfähiger Zellen, mittlerer Zelldurchmesser, Volumen lebensfähiger Zellen) und die Konzentration von Schlüsselsubstraten und Metaboliten sowohl auf intrazellulärer als auch auf extrazellulärer Ebene berücksichtigen. Es beschreibt auch die Bildung des Produkts Alpha1-Antitrypsin. Die Gültigkeit des Modells wurde anhand experimenteller Daten von vier unabhängigen Batch-Kulturen in verschiedenen Größenordnungen (0.5 und 2.5 Liter) in einem chemisch definierten Medium bewertet. Unter Verwendung derselben Parameter und spezifischer Anfangsbedingungen für jedes Experiment konnten die Modellsimulationen die Gesamtdynamik aller Experimente gut wiedergeben. Die Analyse der simulierten intrazellulären Raten ergab mindestens zwei unterschiedliche zelluläre physiologische Zustände. Der erste Zustand war durch eine hohe glykolytische Rate und eine hohe Laktatproduktion gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu war der zweite Zustand durch eine effiziente ATP-Produktion, eine niedrige glykolytische Rate und Reaktionen des TCA-Zyklus (Tricarbonsäurezyklus) gekennzeichnet, die in umgekehrter Richtung von Alpha-Ketoglutarat zu Citrat ablaufen. Das Modell wurde verwendet, um die Auswirkungen von Änderungen der Medienzusammensetzung und der maximalen Enzymaktivität auf den intrazellulären Stoffwechsel vorherzusagen. Schließlich wurden auf der Grundlage der Erkenntnisse aus dieser Arbeit Möglichkeiten zur Verbesserung des Zellwachstums und Maßnahmen zur Etablierung eines effizienteren Stoffwechsels erörtert. Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Erstellung eines dynamischen mathematischen Modells zur Beschreibung des Zellwachstums, des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels und der Influenza-A-Virus (IAV)-Produktion in MDCK-Suspensionszellen. Diese Modellstruktur basiert auf dem zuvor erstellten Modell für eine menschliche Designer- Zelllinie (AGE1.HN.AAT, erstes Ziel dieser Arbeit) und berücksichtigt zusätzliche Aspekte im Zusammenhang mit der IAV-Vermehrung. Das Modell besteht aus 35 gewöhnlichen Difefrentialgleichungen, die das Zellwachstum, die Konzentrationen der wichtigsten Metaboliten und die Virusproduktion (Virustiter) berücksichtigen. Die meisten Modellparameter wurden anhand von experimentellen Daten aus einer mock-infizierten (nicht infizierten) Zellkultur geschätzt. Unter Verwendung der ermittelten Parameter und der spezifischen Anfangsbedingungen für jedes Experiment konnten die Modellsimulationen die Gesamtdynamik der mock-infizierten Kultur genau erfassen und die Dynamik der Kulturen mit infizierten Zellen weitgehend vorhersagen. In den ersten 24 Stunden schien die IAV-Infektion nur eine vernachlässigbare Auswirkung auf den intrazellulären Stoffwechsel zu haben, wobei die meisten Änderungen der Stoffwechselraten als direkte Folge des Zellwachstumsstopps, der virusinduzierten Apoptose, der Zellschädigung und der Zelllyse auftraten. Einige bemerkenswerte Ausnahmen waren die Dynamik der Glutamat- und Ammoniumfreisetzung zu späteren Infektionszeitpunkten (>24 hpi). Auf der Grundlage der Modellsimulationen mit einzigartigen identifizierten Parametern, welche die Dynamik von nicht infizierten und infizierten Zellen weitgehend erfassen, wurde der Schluss gezogen, dass die IAV- Infektion nur einen geringen Einfluss auf den zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel von MDCK-Suspensionszellen hat. Die meisten metabolischen Veränderungen ließen sich direkt erklären, wenn man die Einstellung des Zellwachstums während der Virusinfektion und den anschließenden Übergang zu Apoptose und Zelltod berücksichtigt. Zusätzliche In-silico-Studien wurden durchgeführt, um die Ursache für die Diskrepanz zwischen experimentellen Daten und Modellsimulationen für Glutamat und Ammonium während der späten Infektionsphasen zu untersuchen. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Diskrepanz auf den Abbau von Aminosäuren durch Enzyme im Bioreaktor zurückzuführen sein könnte, der durch die Zelllyse in der späten Infektionsphase ausgelöst wird. Insgesamt hat diese Arbeit gezeigt, dass Zellwachstum, intrazellulärer Stoffwechsel und extrazelluläre Nebenproduktakkumulation mit einem relativ einfachen Modell (wenige Parameter, <150) gut beschrieben werden können, wenn die entsprechenden experimentellen Daten verfügbar sind. Darüber hinaus ermöglichen Modellsimulationen die Identifizierung einzigartiger Stoffwechselzustände und klären den Übergang zwischen dem Warburg-Effekt (ineffiziente Glykolyse) und einem effizienteren Stoffwechsel (geringe Glykolyse, Laktatverbrauch und aktive TCA) auf. Ein solches Modell kann für die Entwicklung von Medien verwendet werden, was in der pharmazeutischen Industrie sehr wünschenswert ist, und bietet ein solides Instrument zur Ermittlung von Veränderungen im Stoffwechsel während einer Virusinfektion.