Bioprocess intensification of cell-free enzymatic cascades for the synthesis of CDP-glycerol, CMP-Neu5AC, GDP-fucose and LNFP III

Abstract

Sugars represent one of the most prevalent and significant classes of chemicals on our planet. They can be found as conjugated glycans within various proteins and other macromolecules essential to biology, which has facilitated technologies like the development of glycoconjugate vaccines targeting bacterial pathogens. They also serve as essential sources of energy and nutrition in various forms within our food, spanning from glucose to Human Milk Oligosaccharides (HMOs). Notably, in infant nutrition, the incorporation of HMOs, alongside human-like protein and fat sources, represents a pivotal advancement in developing healthier alternatives to cow milk-based infant formulas. HMOs are synthesised in nature from nucleotide sugars, including uridine diphosphate glucose (UDP-Glc), uridine diphosphate galactose (UDP-gal), guanosine diphosphate fucose (GDP-fucose), and cytidine monophosphate N-acetyl neuraminic acid (CMP-Neu5Ac), making it important to develop processes to produce them. Since the discovery and isolation of Leloir-glycosyltransferases in the 1950s, carbohydrate scientists worldwide have been working on using these enzymes for synthesising many oligosaccharides under mild conditions. These enzymes transfer a sugar moiety from a donor (nucleotide sugar) to an acceptor molecule with high specificity. Enzymatic methods can be performed at room temperature and have the potential to achieve perfect stereoselectivity. In contrast, the chemical synthesis of oligosaccharides is challenging, requires several reaction steps, and often results in low stereospecificity. However, two key challenges remain for the widespread application of Leloir-glycosyltransferases: the availability of enzymes and the accessibility of nucleotide sugars. This work addresses the latter and takes steps toward the economically viable sourcing of nucleotide sugars. To this end, nucleotide sugars were produced in One-Pot Multi-Enzyme (OPME) cell-free enzymatic cascades, which were improved in a series of process intensification steps, such as the co-expression of enzymes and the optimisation of reaction parameters. This work presents the synthesis of cytidine diphosphate glycerol (CDP-glycerol), CMP-Neu5Ac, and GDP-fucose, with a final chapter dedicated to a use-case scenario that extends the GDP-fucose enzymatic cascade to produce the HMO Lacto-N-fucopentaose III (LNFP III). The first target molecule, CDP-glycerol, is the nucleotide-activated form of glycerol that has recently been utilised in the development of novel glycoconjugate vaccines, particularly those that include synthetic teichoic acid fragments. A new enzymatic cascade capable of synthesising CDP-glycerol was developed. After optimisation using a Design of Experiments (DoE) approach, it achieved a substrate conversion yield of 89 % and a product titer of 31.2 mM at a 200 µl scale. The second target molecule, CMP-Neu5Ac, is an acidic nucleotide sugar that can act as a substrate in the enzymatic synthesis of HMOs and the in vitro glycoengineering of therapeutic proteins. After completing the process intensification steps for enzyme co-expression and DoE optimisation, the reaction could be scaled to produce 6.2 g of product with a 98 % substrate conversion yield. The third target molecule was GDP-fucose, one of the costliest nucleotide sugars available and among the most interesting to produce at large scales. The process intensification steps of kinetic modelling, enzyme co-expression, DoE optimisation, and scaling to gram-scale production were completed. Using the optimised method, a total of 1.76 g could be produced with a 97.8 % substrate conversion yield in a one-pot batch reaction. Finally, the GDP-fucose producing enzymatic cascade was extended to an enzymatic cascade for the synthesis of LNFP III. The HMO could be synthesised to a product titer of 6.8 mM in a 200 µL scale, showcasing the potential of nucleotide sugar synthesis cascades to be used modularly in producing HMOs. This study closes the gap between academic research and commercial application by utilising a variety of process intensification and reaction engineering methodologies aimed at improving established, yet underdeveloped, enzymatic cascades for the synthesis of nucleotide sugars.

Zucker sind eine der am weitesten verbreiteten und wichtigsten Klassen von Chemikalien auf unserem Planeten. Sie sind als konjugierte Glykane in verschiedenen Proteinen und anderen Makromolekülen zu finden, die für die Biologie wichtig sind, was die Entwicklung von Glykokonjugat-Impfstoffen gegen bakterielle Krankheitserreger erleichtert hat. Sie dienen auch als wesentliche Energie- und Nährstoffquellen in verschiedenen Formen in unserer Ernährung, von Glukose bis hin zu humanen Milcholigosacchariden (HMOs). Insbesondere in der Säuglingsernährung stellen HMOs neben menschenähnlichen Protein- und Fettquellen einen entscheidenden Fortschritt bei der Entwicklung gesünderer Alternativen zu Säuglingsnahrung auf Kuhmilchbasis dar. HMOs werden in der Natur aus Nukleotidzuckern wie Uridindiphosphat-Glukose (UDP-Glc), Uridindiphosphat-Galaktose (UDP-Gal), Guanosindiphosphat-Fukose (GDP-Fukose) und Cytidinmonophosphat-N-Acetyl-Neuraminsäure (CMP-Neu5Ac) synthetisiert, weshalb es wichtig ist, Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln. Seit der Entdeckung und Isolierung der Leloir-Glykosyltransferasen in den 1950er Jahren haben Forscher weltweit daran gearbeitet, diese Enzyme für die Synthese zahlreicher Oligosaccharide unter milden Bedingungen einzusetzen. Diese Enzyme übertragen mit hoher Spezifität ein Zuckermolekül von einem Donor (Nukleotidzucker) auf ein Akzeptormolekül. Enzymatische Methoden können bei Raumtemperatur durchgeführt werden und können eine perfekte Stereoselektivität erreichen. Im Gegensatz dazu ist die chemische Synthese von Oligosacchariden schwierig, erfordert mehrere Reaktionsschritte und führt häufig zu einer geringen Stereospezifität. Für die breite Anwendung von Leloir-Glykosyltransferasen gibt es jedoch noch zwei zentrale Herausforderungen: die Verfügbarkeit der Enzyme und die Verfügbarkeit der Nukleotidzucker. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit letzterem und unternimmt Schritte in Richtung einer wirtschaftlich tragfähigen Beschaffung von Nukleotidzuckern. Zu diesem Zweck wurden Nukleotidzucker in zellfreien One-Pot-Multi-Enzyme (OPME)-Enzymkaskaden hergestellt, die durch verschiedene Prozessintensivierungsschritten, wie die Koexpression von Enzymen und die Optimierung der Reaktionsparameter, verbessert wurden. In dieser Arbeit wird die Synthese von Cytidindiphosphatglyzerin (CDP-Glyzerin), CMP-Neu5Ac und GDP-fucose vorgestellt, wobei das letzte Kapitel einem Anwendungsszenario gewidmet ist, das die GDP-fucose-Enzymkaskade zur Herstellung der HMO Lakto-N-Fucopentaose III (LNFP III) erweitert. Das erste Zielmolekül, CDP-Glyzerin, ist die nukleotidaktivierte Form von Glyzerin, die in jüngster Zeit bei der Entwicklung neuartiger Glykokonjugat-Impfstoffe, insbesondere solcher, die synthetische Teichonsäurefragmente enthalten, eingesetzt wurde. Für die Synthese von CDP-Glyzerin wurde eine neue enzymatische Kaskade zur Synthese von CDP-Glyzerin. Nach der Optimierung durch einen DoE-Ansatz (Design of Experiments) wurde eine Substratumwandlungsausbeute von 89 % und ein Produkttiter von 31,2 mM im 200-µl-Maßstab erreicht. Das zweite Zielmolekül, CMP-Neu5Ac, ist ein saurer Nukleotidzucker, der als Substrat für die enzymatische Synthese von HMOs und dem In-vitro-Glycoengineering von therapeutischen Proteinen dienen kann. Nach Abschluss der Prozessintensivierungsschritte zur Enzymkoexpression und die DoE-Optimierung konnte die Reaktion so skaliert werden, dass 6,2 g Produkt mit einer Substratumwandlungsausbeute von 98 % erhalten wurden. Das dritte Zielmolekül war GDP-fucose, einer der teuersten verfügbaren Nukleotidzucker und einer der interessantesten für die Herstellung in großem Maßstab. Die Prozessintensivierungsschritte der kinetischen Modellierung, der Koexpression des Enzyms, der DoE-Optimierung und der Skalierung auf die Produktion im Gramm-Maßstab wurden abgeschlossen. Mit der optimierten Methode konnten insgesamt 1,76 g mit einer Substratumwandlungsausbeute von 97,8 % in einer One-Pot-Batch-Reaktion hergestellt werden. Schließlich wurde die GDP-fucose produzierende Enzymkaskade um die Synthese von LNFP III erweitert. Das HMO konnte in einem Maßstab von 200 µL bis zu einem Produkttiter von 6,8 mM synthetisiert werden, was das Potenzial von Nukleotidzuckersynthesekaskaden für den modularen Einsatz bei der Herstellung von HMOs verdeutlicht. Diese Arbeit schließt die Lücke zwischen akademischer Forschung und kommerzieller Anwendung, indem sie eine Reihe von Methoden zur Prozessintensivierung und Reaktionstechnik eingesetzt werden, um etablierte, aber unterentwickelte enzymatische Kaskaden für die Synthese von Nukleotidzuckern zu verbessern.