Method development and its application for N-glycan analysis of influenza A virus antigens

Abstract

Die Glykosylierung gilt als kritisches Qualitätsmerkmal für die Herstellung von rekombinanten Biopharmazeutika wie monoklonalen Antikörpern – jedoch nicht für virale Impfstoffe. Die Antigene des Influenza-A-Virus (IAV), Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA), haben mehrere potentielle N-Glykosylierungsstellen. In der Vergangenheit wurden starke Auswirkungen auf Virulenz und Immunogenität in Abhängigkeit der Veränderung der Mikro- und Makroheterogenität der N-Glycosylierung nachgewiesen. Früheren analytischen Verfahren fehlt jedoch die Fähigkeit, sowohl die fein-strukturelle Glykan Information (spezifische Struktur der Oligosaccharose), als auch die Position eines Glykans auf dem Glykoprotein (Ortsspezifität) parallel zu identifizieren. Um diese Informationen zu erhalten, wurden in dieser Arbeit zwei Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie-basierte Methoden kombiniert. Zusätzlich wurde zur Identifizierung aller potenziellen N-Glykosylierungsstellen der IAV-Glykoproteine, eine neu entdeckte „Glyko“-Spezifität des Enzyms Flavastacin validiert, die zu einer spezifischen Spaltung am C-Terminus von N-glykosyliertem Asparagin führt. Somit konnte die Anzahl identifizierter Glykosylierungsstellen optimiert werden. Darüber hinaus wurde die Flüssigchromatographie mittels porösem graphitisierten Carbon mit einem nach der Säule geschaltetem zusätzlichen Fluss mit 100% Acetonitril bestückt, da aufgrund der hohen Oberflächenspannung des wässrigen Puffers die Bildung von Tröpfchen erfolgte. Dies führte zu einem stabilen Spray und somit zu einer verbesserten Signaldetektion von freien N- und O-glykanen, insbesondere bei geringerer Retentionszeit. Dadurch wurden die Anzahl und die Qualität von identifizierten fein-strukturellen Glykanen optimiert. Die Kombination beider Erfindungen ermöglichte die umfassende N-Glykosylierungsanalyse beider IAV-Antigene und damit eine kombinierte Charakterisierung der spezifischen N-Glykan-Strukturen (Verlinkung, Verzweigung, Art des Epitopes) der viralen Antigene sowie deren N-Glykan-Mikro- und Makroheterogenitäten. Dieser Arbeitsablauf wurde mit dem IAV Stamm A/PR/8/34 H1N1 getestet, welcher in zwei verschiedenen “Madin-Darby Canine Kidney” (MDCK)-Zelllinien vermehrt wurde, nämlich einer adhärenten und einer suspensions MDCK-Zelle-Linie. Die Analyse der viralen Antigen-Glykosylierung beider Wirtszelllinien führte zu ähnlichen N-Glykanen, jedoch mit unterschiedlichen relativen Häufigkeiten der einzelnen N-Glykan-Strukturen. Eine detaillierte Analyse der HA-N-Glykan-Mikroheterogenität zeigte im Vergleich zur HA Stammregion eine Zunahme der N-Glykan-Variabilität und -Komplexität für N-Glykosylierungsstellen, die näher an der Kopfregion des Moleküls liegen. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass NA ausschließlich an der Stelle N73 N-glykosyliert ist. Weiter wurde gezeigt, dass fast alle N-Glykan-Strukturen am Kern fucosyliert waren (meistens in Kombination mit einer Antennen-Fucosylierung. N-Glykan Strukturen am HA und NA-Antigen waren ausschließlich hybrid- und komplexartige Strukturen, welche teilweise mit alpha-verknüpften Galactosen (Galili-Epitop) sowie Epitopen der Blutgruppe H Typ 2 und der Blutgruppe A terminiert sind. Mit Galili-Epitopen dekorierte Strukturen sind in menschlichen Zellen nicht zu finden und könnten daher im Zusammenhang mit einem Influenza Impfstoff zu einer erhöhten Immunogenität führen und als eine Art Adjuvans fungieren. Eine bessere Charakterisierung der N-glykosylierung von viralen Antigenen durch diesen Arbeitsablauf generiert umfassende Datensätze, welche in Kombination mit Tierversuchen bezüglich der Immunogenität, eine Evaluierung der Bedeutung der Glykosylierung von viralen Proteinen als Qualitätsattribut in der Impfstoffherstellung ermöglichen.

Glycosylation is considered as a critical quality attribute for the production of recombinant biopharmaceuticals such as monoclonal antibodies – but not for viral vaccines. The influenza A virus (IAV) antigens hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) have multiple potential N-glycosylation sites. In the past, strong effects on virulence and immunogenicity upon alteration of the N-glycan micro- and macroheterogeneity were demonstrated. Previous analytical methods lack the ability of providing both, the fine structural glycan information (specific structure of the oligosaccharose) and the location of a glycan on the glycoprotein (site-specificity). Here, two liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) based methods were combined to obtain all this information from the glycoproteins. Additionally, to identify all potential N-glycosylation sites of the IAV glycoproteins, a newly identified “glyco”-specificity of the enzyme flavastacin was found resulting in a specific cleavage of the C-terminus of N-glycosylated asparagine. This optimized the number of detected glycosylation sites. Furthermore, porous grafitized carbon (PGC)-LC was equipped with a post-column make-up flow of 100% acetonitril, because the high surface tention of the aquatic buffer system resulted in the formation of droplets. This resulted in a more stable spray and therefore in an increased MS signal detection of released N- and O-glycans, especially at lower retention time. Thereby the number and quality of identified fine-structural glycans was optimized. Combining both approaches enabled the comprehensive N-glycosylation analysis of both IAV antigens and provided a detailed characterization of the viral antigen N-glycan structures (linkages, branching, type of epitopes) and of the N-glycan micro- and macroheterogeneities. This workflow was tested with the IAV strain A/PR/8/34 H1N1 propagated in two different Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell lines, namely an adherent MDCK cell line and its corresponding suspension cell line. Viral antigen glycosylation of both host cell lines resulted in similar N-glycan patterns, but with different relative abundances of the individual N-glycan structures. Detailed analysis of the HA N-glycan microheterogeneity showed an increase of the N-glycan variability and complexity for N-glycosylation sites located closer to the head region of the molecule. In contrast, NA was found to be exclusively N-glycosylated at site N73. In general, almost all N-glycan structures were found to be core-fucosylated (mostly in combination with an antenna-fucosylation). Furthermore, HA and NA N-glycan structures were found to be exclusively hybrid- and complex-type structures, to some extent terminated with alpha-linked galactoses (Galili-epitope) as well as blood group H type 2 and blood group A epitopes. Galili-epitope decorated structures cannot be found in human cells and could therefore lead to increased immunogenicity, functioning as a sort of adjuvant in combination with an influenza vaccine. A better characterization of viral antigen N-glycosylation by using this workflow resulting in very comprehensive data sets, that, together with animal studies on immunogenicity, will allow evaluating the importance of viral protein glycosylation as a quality attribute in vaccine manufacturing.