Continuous upstream processing for cell culture-derived virus production

Abstract

Viral vaccines are one of the most successful medical developments in human history. Since their introduction in the global health system, the average human life span and the worldwide population have increased dramatically. The most common method for viral vaccine manufacturing is the propagation in different substrates of the target virus in a high concentration. In a next step, the virus particles are inactivated (if needed) and purified to its final presentation. The substrates used for propagation of viruses could vary according to the application and amounts needed, but living tissues, embryonated chicken eggs or animal cell cultures have been the most common substrates. Most vaccine production processes are currently operated in batch mode meaning that large scale production requires the repetition of several batch cycles. Batch operation is efficient for production of defined and relatively small volumes, but several limitations arise when scale-up to large volumes is required. Moving from batch to continuous-flow processing can increase efficiency because reactor sizes are reduced, short seed trains are possible, and the manufacturing footprint can be reduced. However, aspects such as the stability of suspension cell lines after weeks of continuous cultivation, the genetic stability of the virus after many days of propagation, or the low virus yields that might arise due to the accumulation of defective interfering particles (DIP) need further investigation. In this work, continuous production of Modified Vaccinia Ankara (MVA) and influenza viruses were investigated. MVA virus is a candidate for production of recombinant viral vaccines and viral vectors production, for which the use of cascades of continuous stirred tank bioreactors (CSTRs) was investigated. On the other hand, influenza virus is responsible of global seasonal outbreaks and its production in cascades of CSTRs has shown low yields due to the presence of DIPs. Hence, a novel bioreactor system based in a plug-flow tubular bioreactor (PFBR) that allows stable influenza virus production avoiding DIPs-induced low yields was developed. The continuous system for MVA virus production consisted of a cascade of CSTRs, also referred as a two-stage stirred tank bioreactor (TSB). In the TSB, the avian cell line AGE1.CR.pIX was successfully maintained for 30 days and the virus was propagated for 18 days. The system allowed stable production of MVA virus with a total production of 7.1 L and an average TCID50 titer of 9.0×107 virions/mL. Similarly, a small-scale semi-continuous two-stage cultivation system (small-scale cultivation or SSC) consisting of two shaker flasks in series was established as a scale down model of the TSB system. Cells and MVA virus were propagated in the SSC system between 8-18 days and the impact that process parameters such as residence times and other process parameters might have on virus yields were evaluated. A total of 1 L was produced per SSC experiment with MVA virus titers of up to 0.1-1×109 virions/mL. A genetic stability analysis of a recombinant MVA virus containing a green-fluorescent-protein (GFP) revealed that the virus is stable at least over 16 days of cultivation. The SSC system worked well as a fast and efficient tool for design and optimization of the TSB system. Influenza virus was continuously produced using a continuous tubular bioreactor system, newly established within the scope of this study. The system consisted of a 500 mL CSTR connected to a 211 mL PFBR with a nominal flow rate of 12 mL/h. The canine suspension cell line MDCK and the avian cell line AGE1.CR.pIX (AGE1, ProBioGen) were continuously produced in the CSTR and transferred to the PFBR with the aid of a peristaltic pump. The MDCK- or AGE1-adapted influenza virus strain A/PR/8/34 (Robert Koch Institute) was used to prepare a virus stock for infection. The virus seed was continuously pumped to the PFBR to infect the cells. Air was injected immediately after infection generating segments of medium and bubbles. Uninterrupted operation without cell sedimentation was possible for up to two months. The residence time in the PFBR was maintained stable at around 20 h. The tubular bioreactor system enabled stable production of cells, with virus titers ranging between 1.5 and 2.5 log10 (HA Units/100 μL) for AGE1 and MDCK cells, respectively, overcoming the DIPs-induced oscillations observed for influenza virus propagation in cascades of CSTRs. Analysis of DIP accumulation using Polymerase Chain Reaction showed a stable ratio of influenza virus segments S1, S2 and S3 to DIPs over three weeks of production compared to control experiments using batch and the SSC system. Overall, MVA virus was stable and efficiently produced in continuous and semi-continuous cultivations, which demonstrates that the TSB system is a promising platform that can be considered for industrial production of MVA-derived recombinant vaccines and viral vectors. Stable continuous influenza virus production without DIPs-induced oscillations was possible in a PFBR. The PFBR is an innovation that can be considered for commercial production of influenza vaccines. Finally, the experimental work presented here provided valuable results into virus production in continuous mode. In particular, the development of a novel continuous bioreactor based in a PFBR represents a significant step forward in continuous production of cell culture-derived viruses. This technology contributes to the production of cost-effective viral vaccines against influenza outbreaks that affect human populations worldwide. This development offers an alternative for safe and stable continuous production of cell culture-derived viruses.

Virusimpfstoffe sind eine der erfolgreichsten medizinischen Entwicklungen in der Geschichte der Menschheit. Seit ihrer Einführung im globalen Gesundheitssystem haben die durchschnittliche Lebenserwartung des Menschen und die Weltbevölkerung deutlich zugenommen. Die gebräuchlichste Methode zur Herstellung viraler Impfstoffe ist die Vermehrung des Zielvirus in hoher Konzentration in verschiedenen Substraten. In einem nächsten Schritt werden die Viruspartikel (falls erforderlich) inaktiviert und bis zu ihrer endgültigen Nutzung gereinigt. Die Substrate, die zur Vermehrung von Viren verwendet werden, können je nach Anwendung und benötigten Mengen variieren. Lebende Gewebe, embryonierte Hühnereier oder tierische Zellkulturen waren die häufigsten Substrate. Die meisten Impfstoffproduktionsprozesse werden derzeit im Batch-Modus betrieben, was bedeutet, dass die Produktion in großem Maßstab die Wiederholung mehrerer Batch-Zyklen erfordert. Der Batch-Betrieb ist für die Produktion definierter und relativ kleiner Volumina effizient, es ergeben sich jedoch mehrere Einschränkungen, wenn große Volumina produziert werden sollen. Der Übergang von der Chargen- zur kontinuierlichen Durchlaufverarbeitung kann die Effizienz steigern, da die Reaktorgrößen reduziert werden, kurze Serienvermehrungen möglich sind und die Fertigungsfläche reduziert werden kann. Jedoch müssen Aspekte wie die Stabilität der Suspensionszelllinien nach wochenlanger kontinuierlicher Kultivierung, die genetische Stabilität des Virus, oder auch die geringen Virusausbeuten, durch möglich Anhäufung fehlerhafter interferierender Partikel (DIP) weiter berücksichtigt werden. In dieser Arbeit wurde die kontinuierliche Produktion von Modified Vaccinia Ankara (MVA)- und Influenza-Viren untersucht. Das MVA-Virus ist ein Kandidat für die Herstellung von rekombinanten viralen Impfstoffen und viralen Vektoren. Für diese wurde die Herstellung in Kaskaden in kontinuierlichen Rührkessel-Bioreaktoren (CSTRs) untersucht. Andererseits ist das Influenzavirus für weltweite saisonale Ausbrüche verantwortlich, und seine Produktion in Kaskaden von CSTRs hat aufgrund des Vorhandenseins von DIPs geringe Erträge gezeigt. Daher wurde ein neuartiges Bioreaktorsystem entwickelt, das auf einem Plug-Flow-Röhren-Bioreaktor (PFBR) basiert und eine stabile Influenzavirus-Produktion unter Vermeidung von DIPs-induzierten niedrigen Ausbeuten ermöglicht. Das kontinuierliche System zur Herstellung von MVA-Viren bestand aus einer Kaskade von CSTRs, auch als zweistufiger Rührkessel-Bioreaktor (TSB) bezeichnet. In der TSB wurde die Vogelzelllinie AGE1.CR.pIX 30 Tage erfolgreich aufrechterhalten und das Virus 18 Tage vermehrt. Das System ermöglichte eine stabile Produktion des MVA-Virus mit einer Gesamtproduktion von 7,1 liter und einem durchschnittlichen TCID50-Titer von 9,0×107 Virionen/ml. In ähnlicher Weise wurde ein halbkontinuierliches zweistufiges Kultivierungssystem im kleinen Maßstab (Small Scale Cultivation oder SSC), das aus zwei in Reihe geschalteten Schüttelkolben besteht, als ein verkleinertes Modell des TSB-Systems etabliert. Zellen und MVA-Viren wurden zwischen 8 und 18 Tagen im SSC-System vermehrt. Dabei wurde die Auswirkung der Verweilzeiten und andere Prozessparameter auf die Virusausbeute bewertet. Pro SSC-Experiment wurde insgesamt 1 liter mit MVA-Virustitern von bis zu 0,1–1,0×109 Virionen/ml erzeugt. Eine genetische Stabilitätsanalyse eines rekombinanten MVA-Virus, das ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) enthält, ergab, dass das Virus mindestens über 16 Kultivierungstage stabil ist. Das SSC-System hat sich als schnelles und effizientes Werkzeug für die Gestaltung und Optimierung des TSB-Systems bewährt. Das Influenzavirus wurde kontinuierlich unter Verwendung eines kontinuierlichen röhrenförmigen Bioreaktorsystems hergestellt, welches im Rahmen dieser Studie neu etabliert wurde. Das System bestand aus einem 500-ml-CSTR, der mit einem 211-ml Pfropfenströmung-Bioreaktor (oder Plug-Flow-Bioreaktor, PFBR) mit einer Nenndurchflussrate von 12 ml/h verbunden war. Die Hundesuspensionszelllinie MDCK und die Vogelzelllinie AGE1.CR.pIX (AGE1, ProBioGen) wurden kontinuierlich im CSTR hergestellt und mit Hilfe einer Peristaltikpumpe in den PFBR überführt. Der MDCK- oder pIX-adaptierte Influenza-Virusstamm A/PR/8/34 (Robert Koch Institute) wurde verwendet, um einen Virusstamm für die Infektion herzustellen. Die Virussaat wurde kontinuierlich in den PFBR gepumpt, um die Zellen zu infizieren. Unmittelbar nach der Infektion wurde Luft injiziert, wodurch Segmente von Medium und Blasen erzeugt wurden. Ein unterbrechungsfreier Betrieb ohne Zellsedimentation war für bis zu zwei Monate möglich. Die Verweilzeit im PFBR wurde bei ca. 20 Stunden stabil gehalten. Das tubuläre Bioreaktorsystem ermöglichte eine stabile Produktion von Zellen mit Virustitern zwischen 1,5 und 2,5 log10 (HA-Einheiten/100 μl) für AGE1- bzw. MDCK-Zellen, um die DIPs-induzierten Oszillationen zu überwinden, die für die Influenzavirus-Vermehrung in Kaskaden von CSTRs beobachtet wurden. Die Analyse der DIP-Akkumulation unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zeigte ein stabiles Verhältnis der Influenzavirus-Segmente S1, S2 und S3 zu den DIPs über einen Produktionszeitraum von drei Wochen, im Vergleich zu Kontrollexperimenten unter Verwendung von Chargen- und SSC-System. Insgesamt war das MVA-Virus bei kontinuierlichen und halbkontinuierlichen Kultivierungen stabil und effizient. Dies zeigt, dass das TSB-System eine vielversprechende Plattform für die industrielle Produktion von MVA-abgeleiteten rekombinanten Impfstoffen und viralen Vektoren sein kann. In einem PFBR war eine stabile kontinuierliche Influenza-Virus-Produktion, ohne DIPs-induzierte Oszillationen, möglich. Die PFBR ist eine Innovation, die für die kommerzielle Herstellung von Influenza-Impfstoffen in Betracht gezogen werden kann. Schließlich lieferten die hier vorgestellten experimentellen Arbeiten wertvolle Ergebnisse für die Virusproduktion im kontinuierlichen Modus. Insbesondere die Entwicklung eines neuen kontinuierlichen Bioreaktors auf der Basis eines PFBR stellt einen bedeutenden Fortschritt bei der kontinuierlichen Produktion von, aus Zellkulturen stammenden, Viren dar. Diese Technologie trägt zur Herstellung kostengünstiger Virusimpfstoffe gegen Influenza-Ausbrüche bei, die die Weltbevölkerung betreffen. Zudem bietet diese Entwicklung eine Alternative für die sichere und stabile kontinuierliche Produktion von, aus Zellkulturen stammenden, Viren.