Mathematical models of influenza A virus infection : elucidating the impact of host cell factors and defective interfering particles on virus growth

Abstract

Influenza viruses, with the influenza A virus (IAV) being their most prominent representative, are major human pathogens that pose an ongoing burden on global public health and economics. They cause a disease of the respiratory tract, that affects up to 20% of the global population and costs up to 650 000 lives during seasonal epidemics every year. Most importantly, the emergence of new virus variants from wild life reservoirs or by virus mutation are a continuous threat due to their potential of causing an influenza pandemic. To successfully counteract the burden related to influenza infections, we have to gain a detailed understanding of the viral life cycle and develop potent prophylactic and therapeutic strategies. This thesis shows how mathematical models of IAV infection can improve our quantitative and mechanistic understanding of the viral life cycle at the intracellular and the cell population level. More precisely, we explore options to improve the production of influenza vaccines and novel virus-based antivirals by investigating the impact of host cell factors and defective interfering particles (DIPs) on virus growth. While the timely and sufficient supply of vaccines and antivirals is of utmost importance in the fight against influenza, we still struggle to determine and release bottlenecks that limit high yields of biopharmaceutical production processes. The most sustainable measure to limit spread of IAV-related diseases is annual vaccination. The growing global demand for low-cost vaccines requires the establishment of high-yield production processes. Thus, the first part of this thesis addresses the question how cell culture-based vaccine production can be optimized using the option of cell line engineering. For this, novel vaccine producer cell lines can be engineered by manipulating the gene expression of host cell factors relevant for virus replication. To address this option in silico, we employed a deterministic intracellular model of IAV infection, previously developed by the Bioprocess Engineering (BPE) group, to identify potential bottlenecks in the viral life cycle. Model predictions indicate that steps of viral RNA synthesis, its regulation, and particle assembly and virus budding are promising targets for cell line engineering. The importance of these steps was confirmed in four of five candidate cell lines that overexpressed one selected gene. Those showed small, but reproducible changes in early dynamics of viral RNA synthesis and virus release. Model-based analysis suggests, however, that overexpression of the selected host cell factors negatively influences specific viral RNA synthesis rates. Still, virus yields were rescued by an increase in the virus release rate. Based on parameter estimations, we predicted that there is a potential benefit associated with overexpressing multiple host cell genes in one cell line, which was validated qualitatively in experiments. Overall, this model-based study on IAV replication dynamics in engineered cell lines provides a step forward in the quantitative characterization of IAV-host cell interactions. Furthermore, it suggests targets for gene editing and indicates that overexpression of multiple host cell factors may be beneficial for the design of novel producer cell lines. Like many other viral pathogens, IAVs can form DIPs which reduce virus production by competing with the replication of their standard virus (STV). Despite considerable efforts by many research groups, the molecular mechanisms of interference are still not fully understood. In the second part of this thesis, we, thus, aim to shed light on DIP-STV interactions using extended versions of our intracellular IAV model. In particular, we derive three models that account for different interference hypotheses speculating that DIPs have an advantage at the stages of either viral RNA replication, or its regulation, or progeny release. According to in silico analyses evaluating intracellular dynamics of viral genomes and proteins during various infection scenarios, we show that defective interfering RNAs (DI RNAs) with a replication advantage are the strongest antagonists of virus growth. Most intriguingly, the model accounting for this hypothesis can reproduce experimental data, obtained from yield reduction assays and studies testing different co-infection timings, without explicit model fitting. This can be related to the strong competition of those DI RNAs for viral resources needed to form replication-competent genomes. In contrast, DI RNAs that hijack either regulatory steps of the viral life cycle or viral progeny release, interfere less efficiently with STV growth. Nonetheless, comparing simulations for the growth of DIPs with a deletion in different genome segments suggests that DI RNAs derived from polymerase-encoding genes are more competitive than others, independent of their mode of interference. However, for DI RNAs derived from other segments, the interference at stages of RNA synthesis regulation and virus release can even compromise DIP growth. These investigations, thus, help to elucidate the interference mechanisms of DI RNAs and provide novel hypotheses on why certain DI RNAs are more abundant in virus preparations. Furthermore, the various in silico results presented here can contribute to the design of future experiments that allow to discriminate DI RNAs with different modes of interference. In case of DIPs, an improved understanding of their molecular growth mechanisms can directly contribute to the development of novel antiviral agents. In particular, the characteristics related to the reduction in STV yields and induction of the immune response related to DIP co-infection open exciting possibilities in both the clinical and bioprocessing research areas. Previous studies of the BPE group have shown that DIPs hamper optimization of vaccine production in continuous cultures of IAV by inducing periodic drops in viral titers. However, by performing in silico experiments with a simple within-host model, we did not find an economically reasonable option to revert losses in productivity related to DIP growth. Nonetheless, such continuous cultivation systems allow to evaluate STV and DIP replication dynamics over extended time periods. In particular, we used a novel continuous cultivation system, that enables head-to-head comparisons of virus growth at different experimental conditions, to determine characteristics of DIP co-infection related to different residence times of the bioprocess. For this, we extended the within-host model with respect to the obtained experimental data, which allowed interesting insights into crucial infection parameters. For instance, modeling suggests that both STV inactivation and virus degradation have to be taken into account to achieve good agreement of model simulations with the experimental data for the longer of the two residence times. Most intriguingly, we found that only by accounting for STV- and DIP-specific infection rates, the model is able describe the virus growth dynamics reasonably well. Hence, although we did not find a cost-effective way to diminish DIP-induced oscillations in viral titers, continuous production systems represent a valuable tool for model-aided investigations on DIP growth on longer time scales. This can be highly relevant in making informed predictions on DIP-associated virus evolution and pathogenicity of IAVs. Together, mathematical models and simulation approaches presented in this thesis provide valuable insights into factors that represent significant bottlenecks during production of viral biopharmaceuticals needed in the fight against influenza infections. In particular, the intracellular models employed to study the impact of selected host cell factors and DIPs are indispensable in formulating future research questions. Even though we still lack a comprehensive picture of the IAV life cylce, modeling made a significant contribution in providing a step forward in the quantitative characterization of both virus-host cell as well as DIP-STV interactions.

Influenzaviren, mit dem Influenza-A-virus (IAV) als prominentestem Vertreter, sind relevante menschliche Krankheitserreger, die eine fortwährende Belastung für die globale öffentliche Gesundheit und Wirtschaft darstellen. Sie verursachen eine Erkrankung der Atemwege, auch bekannt als Virusgrippe, die jährlich bis zu 20% der Weltbevölkerung betrifft und während saisonaler Epidemien bis zu 650 000 Leben fordert. Vor allem das Auftauchen neuer Virusvarianten aus Wildtierreservoiren oder durch Virusmutationen ist eine ständige Bedrohung, da diese eine Influenza-Pandemie auslösen können. Um der Bedrohung durch Influenza-Infektionen erfolgreich entgegenzuwirken, müssen wir ein detailliertes Verständnis des viralen Lebenszyklus gewinnen, welches die Entwicklung wirksamer antiviraler Strategien vorantreiben kann. Diese Doktorarbeit zeigt, wie mathematische Modelle der IAV-Infektion unser quantitatives und mechanistisches Verständnis des viralen Lebenszykluses auf der intrazellulären und der Zellpopulationsebene verbessern können. Genauer gesagt erforschen wir Möglichkeiten zur Verbesserung der Produktion von Influenza-Impfstoffen und neuartigen Virus-basierten antiviralen Wirkstoffen, indem wir den Einfluss von Wirtszellfaktoren und defekten Viruspartikeln (DIPs) auf das Viruswachstum untersuchen. Während die rechtzeitige und ausreichende Versorgung mit Impfstoffen und antiviralen Mitteln im Kampf gegen die Virusgrippe von größter Bedeutung ist, gibt es noch nennenswerte Limitationen in deren Herstellungsprozessen, die dringend ermittelt und beseitigt werden müssen, um die Produktausbeuten zu steigern. Die nachhaltigste Maßnahme zur Eindämmung von IAV-bedingten Krankheiten ist die jährliche Impfung. Die wachsende globale Nachfrage nach kostengünstigen Impfstoffen erfordert die Etablierung von Produktionsprozessen mit hoher Ausbeute. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich deshalb mit der Frage, wie die Zellkultur-basierte Impfstoffproduktion durch gezielte genetische Modifikation der Produktionszelllinien gesteigert werden kann. Dabei soll in den Zelllinien die Expression solcher Gene manipuliert werden, welche einen signifikanten Einfluss auf die Virusreplikation haben. Um diese Option in silico zu testen, verwenden wir ein deterministisches intrazelluläres Modell der IAV-Infektion, das zuvor von der BPE-Gruppe entwickelt wurde, um mögliche Engpässe im viralen Lebenszyklus zu identifizieren. Modellvorhersagen deuten darauf hin, dass die Schritte der viralen RNA-Synthese, deren Regulation sowie der Freisetzung von Tochterviren vielversprechende Ziele für die Genmanipulation der Zelllinien darstellen. Die Bedeutung dieser Schritte wurde in vier von fünf Kandidaten-Zelllinien bestätigt, die jeweils ein ausgewähltes Gen überexprimierten. Diese zeigten kleine, aber reproduzierbare Veränderungen in der frühen Dynamik der RNA-Synthese und der Virusfreisetzung. Eine Modell-basierte Analyse deutete jedoch darauf hin, dass die Überexpression der ausgewählten Wirtszellfaktoren die spezifischen RNA-Syntheseraten negativ beeinflusste. Dennoch konnten die Virusausbeuten durch eine Erhöhung der Virusfreisetzungsrate mindestens auf das Niveau der parentalen Zelllinie, also der Zelllinie ohne Genmodifikation, gebracht werden. Basierend auf Parameterschätzungen konnten wir des Weiteren vorhersagen, dass es einen potenziellen Vorteil für die Virusproduktion geben könnte, wenn in einer Zelllinie mehrere Wirtszellfaktoren gleichzeitig überexprimiert werden, was in Experimenten qualitativ validiert wurde. Insgesamt stellt diese Modell-basierte Studie zur IAV-Replikation in Zelllinien mit Genmanipulationen einen Fortschritt in der quantitativen Charakterisierung von IAV-Wirtszell-Interaktionen dar. Darüber hinaus schlägt sie limitierende Schritte im Replikationszyklus vor, welche mittels genetischer Manipulation der Produktionszelllinie überwunden werden könnten, und zeigt, dass die Überexpression mehrerer Wirtszellfaktoren für das Design neuartiger Produktionszelllinie von Vorteil sein kann. Wie viele andere virale Pathogene können IAVs DIPs bilden, welche mit der Replikation ihres Wildtyp-Virus (STV) konkurrieren und damit die Virusproduktion reduzieren. Trotz erheblicher Anstrengungen vieler Forschergruppen ist der molekulare Mechanismus dieser Interferenz noch weitgehend ungeklärt. Im zweiten Teil dieser Arbeit versuchen wir deshalb, die DIP-STV-Interaktionen mit Hilfe erweiterter Versionen unseres intrazellulären IAV-Modells zu untersuchen. Insbesondere leiten wir drei Modelle her, die verschiedene Interferenzhypothesen berücksichtigen, die beispielsweise darüber spekulieren, dass DIPs entweder bei den Schritten der RNA-Replikation, deren Regulation oder der Freisetzung von defekten Tochterviren einen Vorteil haben. Anhand von in silico-Analysen, welche die intrazelluläre Dynamik von viralen Genomen und Proteinen während verschiedener Infektionsszenarien auswerten, zeigen wir, dass DIPs mit einem Replikationsvorteil die stärksten Antagonisten des Viruswachstums sind. Insbesondere kann das Modell, das diese Hypothese berücksichtigt, Ergebnisse experimenteller Studien reproduzieren, welche die Reduktion der Virusausbeute sowie des Einflusses des Zeitpunkts der Ko-Infektion untersuchen, ohne das explizite Parameteranpassungen nötig sind. Dies kann mit der starken Konkurrenzfähigkeit dieser DIPs erklärt werden, wodurch virale Ressourcen, die zur Bildung replikationskompetenter Genome benötigt werden, sehr schnell verbraucht werden. Im Gegensatz dazu stören DIPs das STV-Wachstum weniger effizient, wenn sie einen Vorteil in regulatorischen Schritten des viralen Lebenszyklus und bei der Freisetzung von Tochterviren haben. Der Vergleich von Simulationen für das Wachstum von DIPs mit einer Deletion in verschiedenen Genomsegmenten deutet des Weiteren darauf hin, dass defekte virale Genome (DI RNAs), die von Polymerase-kodierenden Genen abstammen, konkurrenzfähiger sind als andere, was unabhängig von der Art des Interferenzmechanismus ist. Im Gegensatz dazu, kann es für DI RNAs, die von anderen Segmenten abstammen, sogar nachteilig sein, wenn diese mit der Regulation der RNA-Synthese oder der Virusfreisetzung interferieren. Unsere Untersuchungen helfen folglich dabei, die Interferenzmechanismen von DI RNAs aufzuklären und neue Hypothesen darüber zu formulieren, warum bestimmte DI RNAs in Viruspräparaten häufiger vorkommen als andere. Darüber hinaus können die verschiedenen hier vorgestellten in silico-Ergebnisse zum Design zukünftiger Experimente beitragen, die es erlauben, DI RNAs mit unterschiedlichen Interferenzmechanismen zu unterscheiden. In Bezug auf DIPs trägt ein verbessertes Verständnis ihrer molekularen Wachstumsmechanismen direkt zur Entwicklung verbesserter antiviraler Wirkstoffe bei. Insbesondere eröffnen die Eigenschaften der DIPs, die mit der Reduzierung der STV-Ausbeute und der Induktion der Immunantwort im Zusammenhang stehen, spannende Möglichkeiten in der klinischen und der biotechnologischen Forschung. Frühere Studien der BPE-Gruppe haben gezeigt, dass DIPs die Optimierung der Impfstoffproduktion in kontinuierlichen Kulturen von IAV behindern, indem sie periodische Oszillationen im Virustiter induzieren. Bei der Durchführung von in silico-Experimenten mit einem einfachen Zellpopulations-Modell fanden wir jedoch keine wirtschaftlich sinnvolle Option, um Produktivitätsverluste im Zusammenhang mit dem DIP-Wachstum zu verhindern. Darüber hinaus wurden Daten aus einem neuen kontinuierlichen Kultivierungssystem untersucht, das direkte Vergleiche der STV- und DIP-Replikationsdynamik über längere Zeiträume ermöglicht, um verschiedene Charakteristika der DIP-Ko-Infektion in Bezug auf die Verweilzeit des Produktionsprozesses zu bestimmen. Hierfür haben wir das Zellpopulations-Modell im Hinblick auf die neuen experimentellen Daten erweitert, was interessante Einblicke in entscheidende Infektionsparameter ermöglichte. Die Modellierung legt zum Beispiel nahe, dass sowohl die STV-Inaktivierung als auch die Degradation von Viren berücksichtigt werden müssen, um eine gute Übereinstimmung der Modellsimulationen mit den experimentellen Daten für die längere der beiden Verweilzeiten zu erreichen. Besonders interessant ist, dass das Modell nur durch die Berücksichtigung von STV- und DIP-spezifischen Infektionsraten in der Lage ist, die Dynamik der Virusreplikation korrekt widerzugeben. Obwohl wir also keinen kosteneffektiven Weg gefunden haben, um DIP-induzierte Oszillationen in den Viruskonzentrationen zu verringern, stellen kontinuierliche Produktionssysteme ein wertvolles Werkzeug für Modell-gestützte Untersuchungen zum DIP-Wachstum über einen längeren Zeitraum dar. Dies ist höchstrelevant, um fundierte Vorhersagen über die DIP-assoziierte Evolution und Pathogenität von IAVs zu treffen. Zusammengenommen liefern die in dieser Arbeit vorgestellten mathematischen Modelle und Simulationsansätze wertvolle Einblicke in Faktoren, die signifikante Limitationen bei der Produktion von viralen Biopharmazeutika darstellen, die dringend im Kampf gegen Influenza-Infektionen benötigt werden. Insbesondere die intrazellulären Modelle, mit denen der Einfluss ausgewählter Wirtszellfaktoren und DIPs auf das Viruswachstum untersucht wurde, sind für die Formulierung zukünftiger Forschungsfragen unerlässlich. Auch wenn uns noch ein umfassendes Bild des IAV-Lebenszyklus fehlt, hat die Modellierung einen wesentlichen Beitrag zur quantitativen Charakterisierung sowohl der Virus-Wirtszell- als auch der DIP-STV-Interaktionen geleistet.