Process intensification and integration for the production of vaccines and viral vectors

Abstract

The use of eukaryotic cell cultures has led to successful production and commercialization of many complex biopharmaceuticals and viral-based vaccines. Since 1940s, this allowed the development of many vaccines against e.g., poliomyelitis and measles. Later in 1986, the first biopharmaceutical was commercialized using Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Especially for biopharmaceuticals production, huge progress in the field of cell culture engineering has been achieved through media and process optimization, and lately process intensification and integration, allowing drastic yield increase. However, few innovations have been implemented for viral-based vaccine production because of relatively low profit margins. Viruses can be used as vaccines, which are among the most cost-effective medical interventions and indispensable for control of pandemic threats, saving annually millions of lives. Viruses can also be used as viral vectors for gene therapy, which is currently revolutionizing medicine in treatments against e.g., cancer, infectious or cardiac diseases. A rising demand for fast and high-yield production processes for viral-based therapeutics has been observed over the past decade. For vaccination, an efficient production process allows to rapidly produce in high amount cost-effective doses for seasonal epidemics and pandemics, such as the COVID-19 pandemic. For viral-based gene therapies, fast and high-yield production processes would allow to decrease production cost (e.g., 2.1 million $ pricing for viral-based Zolgensma® gene therapy treatment) and to accelerate the supply of viral vectors for commercialization and clinical trials. Process intensification and integration in suspension cell culture using chemically-defined medium could be one answer to an ever increasing pressure on manufacturing costs and capacities in virus manufacturing. The process intensification approach consists in increasing host cell concentration by using a cell retention device. The process integration approach consists in directly linking the cell culture with purification. This thesis presents methods for process intensification and integration for influenza A virus (IAV) production, with a possible use as an inactivated virus vaccine against seasonal and pandemic influenza, and for Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) production, with a possible use as a viral vector for vaccination against various challenging pathogens or the treatment of some types of cancers. For IAV production, PBG.PK2.1, a new mammalian suspension cell line is first presented. Evaluation of optimized IAV propagation in high cell density culture using a membrane-based cell retention system demonstrated promising performance: A maximum HA titer of 3.93 log10(HA units/100 μL) was obtained. The glycosylation of the antigen HA was also studied. Second, different cell retention devices for IAV production in perfusion mode were compared and optimized, in order to provide platform knowledge for process intensification of virus production. IAV was produced using AGE1.CR.pIX cells at concentrations up to 50 x 106 cells/mL at similar infection conditions using either a membrane-based system, an acoustic settler or an inclined settler. The virus was successfully harvested through the acoustic settler and the inclined settler cell retention devices. For concentrations of about 25 x 106 cells/mL, perfusion cell cultures using the acoustic settler and the inclined settler showed a 2.0-fold and 3.2-fold increase in the total number of virions produced, compared to the membrane-based system. In addition, a lower amount of large-sized aggregates in the harvest was observed when using the acoustic settler. Overall, a clear advantage was observed for continuous virus harvesting after the acoustic settler or the inclined settler operation mode were optimized. This platform approach was equally applied to MVA production using AGE1.CR.pIX cells: first, different options for cell retention devices in perfusion mode were compared as before. Hollow-fiber bioreactors and an orbital-shaken bioreactor in perfusion mode, both available for single-use, were evaluated as well. Productivity for the virus strain MVA-CR19 was compared to results obtained from batch and continuous production reported in literature. Using a stirred-tank bioreactor, a perfusion strategy with working volume expansion after virus infection resulted in the highest yields. Overall, infectious MVA titers of 2.1–16.5 x 109 TCID50/mL were achieved in these intensified processes. Taken together, this part shows a novel perspective on high-yield MVA production and addresses options for process intensification, also in full single-use. Third, a scalable suspension cell culture-based perfusion process, integrating MVA harvesting through an acoustic settler with semi-continuous purification was developed. A capacitance probe was used to control the perfusion flow rate and to evaluate the optimal time of harvesting. A MVA space-time yield of 1.05 x 1011 TCID50/Lbioreactor/day was obtained for an integrated perfusion process, which is 6-fold higher than for batch cultures. Without further optimization, purification by steric exclusion chromatography resulted in an overall product recovery of 50%. To decrease the level of host cell DNA prior to chromatography, a novel inline continuous DNA digestion step was integrated into the process. A detailed cost analysis comparing integrated production in batch mode versus production in perfusion mode showed that the cost per dose for MVA can be reduced by a factor of 2.8 for this intensified small-scale process. By collecting different process intensification strategies for IAV and MVA, together with process integration and cost analysis approaches for MVA, a sound basis for a better understanding on how to proceed for next generation virus production processes for vaccination or gene therapies is given.

Die Verwendung von eukaryotischen Zellkulturen hat zur erfolgreichen Produktion und Kommerzialisierung vieler komplexer Biopharmazeutika und viraler Impfstoffe geführt. Seit den 1940er-Jahren ermöglichte dies die Entwicklung vieler Impfstoffe gegen z. B. Poliomyelitis und Masern. Später, 1986, wurde das erste Biopharmazeutikum unter Verwendung von Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen kommerzialisiert. Speziell für die Produktion von Biopharmazeutika wurden enorme Fortschritte auf dem Gebiet der Zellkulturtechnik durch Medien- und Prozessoptimierung und in letzter Zeit auch durch Prozessintensivierung und -integration erzielt. Dies ermöglichte eine drastische Steigerung des Ertrags. Für die Impfstoffproduktion auf Virusbasis wurden jedoch aufgrund der relativ geringen Gewinnmargen nur wenige Innovationen umgesetzt. Viren können als Impfstoffe verwendet werden und zählen zu den kosteneffektivsten medizinischen Interventionen. Für die Kontrolle einer Pandemie ist eine kostengünstige Lösung unverzichtbar und kann jährlich Millionen von Leben retten. Zudem können Viren auch als virale Vektoren für die Gentherapie eingesetzt werden. Sie revolutionieren derzeit die Medizin bei der Behandlung von z. B. Krebs, Infektions- oder Herzkrankheiten. In den letzten zehn Jahren ist ein steigender Bedarf an schnellen und ertragreichen Produktionsprozessen für virusbasierte Therapeutika zu beobachten. Für Impfungen ermöglicht ein effizienter Produktionsprozess die schnelle Herstellung von kostengünstigen Dosen in hohen Mengen für saisonale Epidemien und Pandemien, wie z. B. die COVID-19-Pandemie. Für virusbasierte Gentherapien würden schnelle und ertragreiche Produktionsprozesse es ermöglichen, die Produktionskosten zu senken (z.B. kostet die virusbasierte Gentherapie Zolgensma® momentan 2,1 Mio. $) und die Bereitstellung von viralen Vektoren für die Kommerzialisierung und klinische Studien zu beschleunigen. Die Prozessintensivierung und -integration in der Suspensionszellkultur unter Verwendung eines chemisch definierten Mediums könnte eine Antwort auf den immer stärker werdenden Druck auf die Herstellungskosten und Kapazitäten in der Virusherstellung sein. Der Ansatz der Prozessintensivierung besteht in der Erhöhung der Wirtszellkonzentration durch den Einsatz einer Zellhaltevorrichtung. Der Ansatz der Prozessintegration besteht in der direkten Verknüpfung der Zellkultur mit der Aufreinigung. In dieser Arbeit werden Methoden zur Prozessintensivierung und -integration für die Produktion von Influenza-A-Viren (IAV) und Modifizierten Vaccinia-Viren Ankara (MVA) vorgestellt. IAV können als inaktivierter Virusimpfstoff gegen saisonale und pandemische Grippe verwendet werden. MVA können als viraler Vektor für die Impfung gegen verschiedene Krankheitserreger oder die Behandlung einiger Arten von Krebserkrankungen dienen. Für die IAV-Produktion wird zuerst PBG.PK2.1, eine neue Säugetier-Suspensionszelllinie, vorgestellt. Die Evaluierung der optimierten IAV-Vermehrung in Hochzelldichtekultur unter Verwendung eines membranbasierten Zellrückhaltesystems zeigte vielversprechende Ergebnisse: Es wurde ein maximaler HA-Titer von 3,93 log10(HA-Einheiten/100 μL) erreicht. Die Glykosylierung des Antigens HA wurde ebenfalls untersucht. Zweitens wurden verschiedene Zellrückhaltevorrichtungen für die IAV-Produktion im Perfusionsmodus verglichen und optimiert, um eine Plattform für die Prozessintensivierung der Virusproduktion zu schaffen. IAV wurde unter Verwendung von AGE1.CR.pIX-Zellen in Konzentrationen von bis zu 50 x 106 Zellen/mL bei ähnlichen Infektionsbedingungen entweder mit einem membranbasierten System, einem acoustic settler oder einem inclined settler produziert. Das Virus konnte erfolgreich durch den acoustic settler und den inclined settler geerntet werden. Im Vergleich zum membranbasierten System zeigten Perfusionszellkulturen mit dem acoustic settler und dem inclined settler bei Konzentrationen von ca. 25 x 106 Zellen/mL eine 2,0- bzw. 3,2-fache Steigerung der Gesamtzahl der produzierten Virionen. Darüber hinaus wurde bei Verwendung des acoustic settler eine geringere Menge an großformatigen Aggregaten in der Ernte beobachtet. Insgesamt wurde ein klarer Vorteil für die kontinuierliche Virusernte beobachtet, nachdem der acoustic settler oder die Betriebsart des inclined settler optimiert wurden. Dieser Plattformansatz wurde auch auf die MVA-Produktion mit AGE1.CR.pIX-Zellen angewandt: Zunächst wurden wie zuvor verschiedene Optionen für Zellhaltevorrichtungen im Perfusionsmodus verglichen. Zusätzlich wurden hollow-fiber bioreactors und ein orbital-shaken bioreactor im Perfusionsmodus, welche beide für den Einmalgebrauch verfügbar sind, evaluiert. Die Produktivität für den Virusstamm MVA-CR19 wurde mit den in der Literatur berichteten Ergebnissen aus der Batch- und kontinuierlichen Produktion verglichen. Bei Verwendung eines Rührkessel-Bioreaktors führte eine Perfusionsstrategie mit Arbeitsvolumenerweiterung nach der Virusinfektion zu den höchsten Erträgen. Insgesamt wurden in diesen intensivierten Prozessen infektiöse MVA-Titer von 2,1–16,5 x 109 TCID50/mL erreicht. Insgesamt zeigt dieser Teil eine neuartige Perspektive auf die Hochertrags-MVA-Produktion und adressiert Optionen zur Prozessintensivierung auch für full single-use. Drittens wurde ein skalierbarer, auf Suspensionszellkulturen basierender Perfusionsprozess entwickelt, der die MVA-Ernte durch einen acoustic settler mit einer halbkontinuierlichen Aufreinigung integriert. Eine Kapazitätssonde wurde verwendet, um die Perfusionsflussrate zu regeln und den optimalen Erntezeitpunkt zu ermitteln. Eine MVA-Raum-Zeit-Ausbeute von 1,05 x 1011 TCID50/LBioreaktor/Tag wurde für einen integrierten Perfusionsprozess erzielt, was 6-mal höher ist als bei Batch-Kulturen. Ohne weitere Optimierung führte die Aufreinigung durch steric exclusion chromatography zu einem Gesamtproduktertrag von 50 %. Um den Gehalt an Wirtszell-DNA vor der Chromatographie zu verringern, wurde ein neuartiger kontinuierlicher inline-DNA-Verdauungsschritt in den Prozess integriert. Eine detaillierte Kostenanalyse, in der die integrierte Produktion im Batch-Modus mit der Produktion im Perfusions-Modus verglichen wurde, zeigte, dass die Kosten pro Dosis für MVA bei diesem intensivierten Prozess im kleinen Maßstab um den Faktor 2,8 reduziert werden können. Durch die Zusammenstellung verschiedener Prozessintensivierungsstrategien für die Produktion von IAV und MVA sowie die Prozessintegrations- und Kostenanalyseansätzen für die Produktion von MVA, wurde eine solide Grundlage für ein besseres Verständnis für die Vorgehensweise bei Virusproduktionsprozessen der nächsten Generation für Impfungen oder Gentherapien geschaffen.