Bottom-up synthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) regeneration modules for artificial cells

Abstract

With the bottom-up approach to synthetic biology, we are trying to develop an artificial biological system with minimal but essential components in order to better understand the basic mechanisms of life and further refine, advance, and improve it for diverse applications. This approach involves piecing together essential biological functional modules and their further engineering, controlling, and re-designing towards an increasing complexity. Considering a minimal blueprint revolving around metabolism, we envision a synthetic cell consisting of an ATP energy regeneration module, a NAD regeneration module, as well as enzymatic cascades, all enclosed in a common compartment. In this thesis, we aimed to develop NAD regeneration modules for synthetic cells. We have demonstrated a highly simplified and feasible strategy for the transmembrane NAD regeneration by placing NAD inside the membrane and redox agents outside with the aid of mediators embedded in the same membrane. We used different types of membranes in two different testing platforms – black lipid membranes (BLMs) and vesicles and studied the NAD regeneration. Firstly, we investigated the NAD+ regeneration in black lipid membranes with embedded conductive agents and redox catalysts (methylene blue). The molecular wires were successfully embedded in BLMs and the conductivity increased. However, due to the limited stability of the setup, the introduced permeability of the membrane, and the low activity of methylene blue for oxidation of NADH, this approach turned out not to be feasible in the context of the envisioned synthetic cell. Then, we developed a versatile NAD regeneration module via the transmembrane oxidation and reduction of encapsulated NADH/NAD+ facilitated by other mediators embedded in vesicles. In the case of NAD+ regeneration, we thoroughly investigated the process and described the system behaviour through a simple dimensionless kinetic model. Furthermore, we have studied the effects of different membrane compositions at two size scales. These results move us closer to the sustainable redox management of synthetic cells and provide model systems for better understanding of natural membrane-related phenomena.

Mit dem Bottom-up-Ansatz der synthetischen Biologie versuchen wir, ein künstliches biologisches System mit minimalen, aber essentiellen Komponenten zu entwickeln, um grundlegende Mechanismen des Lebens besser zu verstehen und für vielfältige Anwendungen weiter zu verfeinern, voranzutreiben und zu verbessern. Dieser Ansatz beinhaltet die Zusammenstellung wesentlicher biologischer Funktionsmodule und deren weitere Entwicklung, Steuerung und Neugestaltung hin zu einer Komplexitätssteigerung. Unter Berücksichtigung eines minimalen Bauplans, der sich um den Stoffwechsel dreht, stellen wir uns eine synthetische Zelle vor, die aus einem ATP-Energieregenerationsmodul, einem NAD-Regenerationsmodul sowie einer enzymatischen Kaskade besteht, die alle in einem gemeinsamen Kompartiment eingeschlossen sind. In dieser Arbeit war es das Ziel, die NAD-Regenerationsmodule für die synthetischen Zellen zu entwickeln. Wir haben eine stark vereinfachte und praktikable Strategie für die transmembrane NAD-Regeneration entwickelt, indem wir NAD innerhalb der Membran und Redox-Agenzien außerhalb mit Hilfe von in derselben Membran eingebetteten Mediatoren platzierten. Wir verwendeten verschiedene Membrantypen in zwei verschiedenen Testplattformen – schwarze Lipidmembranen (BLMs) und Vesikel – und untersuchten die NAD-Regeneration. Zunächst untersuchten wir die NAD+-Regeneration in schwarze Lipidmembranen mit eingebetteten leitfähigen Substanzen und einem Redoxkatalysator (Methylenblau). Diese molekularen Drähte wurden erfolgreich in BLMs eingebettet und die Leitfähigkeit erhöht. Aufgrund der begrenzten Stabilität des Aufbaus, der eingeführten Permeabilität der Membran und der geringen Aktivität von Methylenblau für die Oxidation von NADH erwies sich dieser Ansatz jedoch im Kontext der anvisierten synthetischen Zelle als nicht praktikabel. Aus diesem Grund entwickelten wir danach ein vielseitiges NAD-Regenerationsmodul aus einer transmembranen Oxidation und Reduktion von eingekapseltem NADH/NAD+, das durch andere in Vesikel eingebettete Mediatoren ermöglicht wird. Im Falle der NAD+-Regeneration haben wir den Prozess gründlich untersucht und das Systemverhalten mit einem einfachen, dimensionslosen kinetischen Modell beschrieben. Darüber hinaus haben wir die Auswirkungen unterschiedlicher Membranzusammensetzungen auf zwei Größenskalen untersucht. Diese Ergebnisse bringen uns dem nachhaltigen Redoxmanagement synthetischer Zellen näher und liefern Modellsysteme zum besseren Verständnis natürlicher Membranphänomene.