Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Klonen aus frühen Stadien der somatischen Embryogenese von Nicotiana plumbaginifolia

Abstract

Molekulare und biochemische Analysen der frühen pflanzlichen Embryogenese werden durch physikalische Unzugänglichkeit und minimale Größe des zygotischen Embryos limitiert. Alternative Experimentalmodelle liefern somatische Embryogenesesysteme, da Entwicklungsstadien somatischer und zygotischer Embryonen Ähnlichkeiten in Morphologie und zellulären Differenzierungsprozessen aufweisen. Als somatisches Embryogenesesystem wurde die direkte somatische Embryogenese von Nicotiana plumbaginifolia genutzt. Embryogeneseinduktion erfolgte an in vitro kultivierten Mesophyllprotoplasten, die ohne intermediäre Kallusbildung mit hoher Frequenz zu somatischen Embryonen differenzieren, aus denen Ganzpflanzen regenerieren. Zur Isolierung von Genen, die in frühen Embryogenesestadien induziert werden bzw. hohe Transkriptionsaktivität aufweisen, wurden die differentiellen Selektionstechniken DDRT-PCR (differential display reverse transcription-PCR) und subtraktive Hybridisierung eingesetzt. RT-PCR und genomische PCR wurden zur gezielten Isolierung von cDNA-Sequenzen für heterotrimere G-Proteine eingesetzt, um experimentelle Daten für ihre Beteiligung am Embryogeneseprozeß zu ermitteln. Aus einer λZAP-ExpressTM-cDNA-Bank, hergestellt aus mRNA-Populationen früher Embryogenese-stadien von N. plumbaginifolia, wurden die korrespondierenden vollständigen cDNA-Klone isoliert. Zur Charakterisierung der isolierten Gensequenzen wurden Entwicklungs-abhängigkeit und Gewebespezifität von RNA- und Proteinexpression, hormon- und streßabhängige Regulation der Transkriptgehalte, Gewebespezifität und intrazelluläre Kompartimentierung der Proteine während der Samenentwicklung und Effekte der Transgenexpression auf RNA- und Proteinebene sowie auf die Pflanzenentwicklung untersucht. Der cDNA-Klon c41-3 kodiert ein dem generellen Transkriptionsfaktor BTF3 homologes Protein, dessen korrespondierende mRNA zwar ubiquitär, jedoch mit Präferenz für frühe Embryogenesestadien exprimiert wird. Der cDNA-Klon pNLA35 kodiert vermutlich die größte Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors 3 aus N. tabacum. In N. plumbaginifolia wurde ein homologes Transkript in embryogenen Stadien und Blättern sowie das entsprechende Protein in Embryo- und Endospermzellen nachgewiesen. DNA- und Proteinsequenz des cDNA-Klons Np22c28 wiesen keine Homologien zu bekannten Datenbank-Sequenzen auf. Vorrangige mRNA-Akkumulation in frühen somatischen Embryogenesestadien und immun-histologischer Nachweis in Samenanlagen während der frühen zygotischen Embryogenese lassen Funktionalität im Embryogeneseprozeß vermuten. Die cDNA-Klone 3Sar und 50Sar kodieren verwandte Sar1-homologe kleine GTP-bindende Proteine. Sie wurden ubiquitär exprimiert und waren intrazellulär membranassoziiert oder vorrangig in Speichervakuolen von Endospermzellen nachzuweisen. Vermutlich sind sie an Vesikeltransportprozessen in allen metabolisch aktiven Zellen und Geweben beteiligt. Die cDNA-Klone βl12/1 und βl3/2 wurden als verwandte WD40-Proteine der RACK1-Subfamilie identifiziert. Sie wurden ubiquitär, aber mit Präferenz für embryogene und teilungsaktive Zellen exprimiert und könnten an Zellteilungsprozessen beteiligt sein. Die cDNA-Klone α2/4 und β16/1 kodieren für eine G-Protein-α- bzw. β-Untereinheit. Ubiquitäre Expression, subzellulare Lokalisierung in Embryo- (überwiegend membranassoziiert) und Endospermzellen sowie Hormontests lassen Funktionen nicht nur in der Embryogenese, sondern in zahlreichen zellulären Prozessen vermuten. Aufgrund von Gemeinsamkeiten und Unterschieden in den mRNA-Expressionsmustern wird angenommen, daß beide Proteine sowohl konzertiert als auch unabhängig voneinander agieren. Keiner der isolierten cDNA-Sequenzen kann Embryogenesespezifität zugeordnet werden. Vermutlich kodieren sie essentielle Proteine von Zellteilungs- und/oder -differenzierungsprozessen und weisen demzufolge in den mitotisch aktiven und differenzierungsintensiven Zellen des Embryos hohe Transkriptgehalte auf. In allen Versuchen mit transgenen antisense- oder Kosuppressions-Pflanzen wurde statt reduzierter, erhöhte Expression der endogenen Transkripte für Gα, Gβ und das WD40-Protein nachgewiesen. Diese Überexpressionseffekte blieben in den nachfolgenden Pflanzengenerationen erhalten, führten jedoch zu keinen phänotypischen Veränderungen.

Molecular and biochemical analyses of the early plant embryogenesis are limited by the inaccessibility and small size of the zygotic embryo. Due to the similarities of zygotic and somatic developmental stages concerning morphology and cellular differentiation processes somatic embryogenesis systems are experimental alternatives. A direct somatic embryo-genesis system from Nicotiana plumbaginifolia was used. In vitro cultivated mesophyll protoplasts develop without intermediary callus formation and with high frequences into somatic embryos which regenerate into plants. To isolate genes, showing induction or high transcription actvity in early embryogenic stages, the differential selection techniques DDRT-PCR (differential display reverse transcription-PCR) and subtractive hybridization were performed. RT-PCR and genomic PCR were used for the specific isolation of cDNA sequences encoding heterotrimeric G proteins to get experimental data for their putative participation in embryogenesis. To isolate the corresponding full-length cDNA clones a λZAP ExpressTM-cDNA-library produced from mRNA populations of early embryogenic stages of N. plumbaginifolia was screened. All isolated gene sequences were characterized concerning developmental and tissue specificity of RNA and protein expression, hormone and stress dependent regulation of their transcript levels, tissue specificity and intracellular compartimentation of their proteins during seed development as well as due to effects of transgene expression on RNA and protein level and on plant development. The cDNA clone c41-3 codes for a homologous protein of the general transcription factor BTF3. It’s corresponding mRNA is expressed ubiquitous, but preferentially in early embryogenic stages. The cDNA clone pNLA35 probably encodes the largest subunit of the translation initiation factor 3 of N. tabacum. In N. plumbaginifolia a homologous transcript was detected in embryogenic stages and leaves and the corresponding protein in cells of embryo and endosperm. Nucleotide and protein sequences of cDNA clone Np22c28 do not show any homologies to known sequences of the data bases. Preferred mRNA accumulation in early somatic embryogenic stages as well as the immunhistological detection of the protein in the ovules during early zygotic embryogenesis indicate possible functions in the embryogenesis process. The cDNA clones 3Sar and 50Sar encode related Sar1-homo-logous small GTP-binding proteins. They are ubiquitously expressed and intracellularly membrane associated or could be detected preferentially in storage vacuoles of endosperm cells. Both proteins probably participate in vesicle transport processes in all metabolically active cells and tissues. The cDNA clones βl12/1 and βl3/2 were identified as related WD40-proteins of the RACK1-subfamily. Both are ubiquitously expressed, but with preference for embryogenic and high proliferating cells and could have functions in cell division processes. The cDNA clones α2/4 and β16/1 encode a G protein α- and β-subunit, respectively. Ubiquitous expression, subcellular localization in cells of embryo (preferentially membrane associated) and endosperm as well as hormone tests indicate possible functions not only during embryogenesis but also in many cellular processes. Because of similarities and differences in their mRNA expression patterns we postulate not only cooperative, but also separate actions of both proteins. None of the isolated cDNA sequences show embryogenesis specificity only. They probably encode essential proteins of cell division and/or differentiation processes and therefore exhibit high transcript levels in the mitotically active and highly differentiating cells of the embryo. In all experiments with transgenic antisense or cosuppression plants an increased instead of reduced expression of the endogenic transcripts for Gα, Gβ and the WD40-protein was detected. The overexpression effect was also maintained in the following plant generations, but did not result in any phenotypic changes.