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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3260
Title: Fluorogene Substrate und Inhibitoren zur Detektion von DP IV-Aktivität auf Immunzellen
Author(s): Lorey, Susan
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 1999
Extent: Online Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Niedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000000556
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Abstract: Chromogene und fluorogene Enzymsubstrate finden breite Anwendung bei der Bestimmung von Aktivitäten isolierter Enzyme. Die Quantifizierung enzymatischer Aktivitäten mittels der genannten Verbindungen auf zellulärem Niveau ist jedoch limitiert. Als Hauptursache führt die Diffusion des enzymkatalysiert freigesetzten Fluorophors zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz des Mediums, die die Detektion enzymatischer Aktivitäten auf Zellen erschwert. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Synthese sowie mit der fluoreszenzspektroskopischen und enzymkinetischen Untersuchung von Rhodamin 110 (R110)-basierenden Substraten der prolinspezifischen Serinprotease Dipeptidylpeptidase IV (DP IV). Ausgehend von Verbindungen der Struktur (Xaa-Pro)2-R110 konnte die Eignung dieser Substrate für die Detektion von Aktivität isolierter DP IV und zellassoziierter DP IV nachgewiesen werden. Ein besonderer Vorteil dieser Verbindungen besteht dabei in der hohen Nachweisempfindlichkeit des Fluorophors R110. Um die Diffusion des Hydrolyseproduktes R110 von der Zelle zu verhindern und damit eine verbesserte Quantifizierung der enzymatischen Aktivität insbesondere bei Untersuchungen in zellulären Systemen zu erreichen, wurden bifunktionelle Verbindungen Xaa-Pro-R110-Y (Xaa = Gly oder Ala) synthetisiert. Der Rest Y repräsentiert eine Ankerstruktur unterschiedlicher Hydrophobizität, Reaktivität und Länge (Y = Halogenalkylcarbonyl-, Halogenalkylarylcarbonyl- und Maleinimidoalkylcarbonyl-Reste). Mit Hilfe dieser reaktiven Ankergruppen konnte eine stabile Fixierung des Fluorophors an der Zelle erreicht werden. Auf diesem Wege war eine fluoreszenzmikroskopische Differenzierung von in ihrer DP IV-Aktivität variierenden Zellen in Analogie zu einer Differenzierung mittels antiDP IV-Antikörpern möglich. Die Anwendung dieser Verbindungen für die Detektion von DP IV-Aktivität mit Hilfe der Duchflußzytofluorimetrie ist limitiert. Es werden verschiedene biologische Effekte als mögliche Ursachen einer eingeschränkten Differenzierung der DP IV-Aktivität auf mononukleären Blutlymphozyten diskutiert. Neben fluorogenen Substraten wurden Nε-4(5)-Carboxyfluorescein- bzw. Biotin-markierte Lys-2-cyanopyrrolidide als spezifische Inhibitoren der DP IV synthetisiert, enzymkinetisch charakterisiert und bezüglich ihrer Eignung für die Lokalisierung zellulärer DP IV untersucht.
Chromogenic and fluorogenic substrates are useful tools for the determination of the activity of isolated enzymes. Unfortunately, the quantification of enzymatic activity in cellular systems using these compounds is limited. A maior obstacle is the diffusion of the enzymatically released fluorophore resulting in a high background fluorescence complicating the detection of enzymatic activity on cells. The present work deals with the synthesis and the spectroscopic and enzymkinetic investigation of rhodamine 110(R110)-based substrates for the prolinespecific serine protease dipeptidylpeptidase IV (DP IV). Based upon compounds of the structure (Xaa-Pro)2-R110, the suitability of these substrates for the detection of activity of isolated as well as cell-associated DP IV was studied. The advantage of these compounds is the high sensitivity of the fluorophore R110. To prevent the diffusion of the hydrolysis product R110 from the cells and thereby to improve the quantification of enzymatic activity especially in cellular systems, bifunctional compounds Xaa-Pro-R110-Y (Xaa = Gly or Ala) were synthesized. The residue Y represents an anchor structure with different hydrophobicity, reactivity and length (Y = halogenalkylcarbonyl-, halogenalkylarylcarbonyl- and maleinimidoalkylcarbonyl-residues). By these reactive anchor groups a stable fixation of the fluorophore on the cell surface was realized. This way, the microscopic differentiation of cells differing in their DP IV activity comparable to the differentiation via antiDP IV antibody staining was possible. The application of these compounds for the detection of DP IV activity using the flow cytometry is limited. In this regard different biological effects as possible reasons for the limited differentiation of DP IV activity on mononuclear blood lymphocytes are discussed. Beside fluorogenic substrates specific inhibitors of DP IV, Nε-4(5)-carboxyfluoresceine- and biotin-labeled Lys-2-cyanopyrrolidides, were synthesized and enzymatically characterized. The suitability of these compounds for the localization of cellular DP IV was studied.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/10045
http://dx.doi.org/10.25673/3260
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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