Analyse des Phänotyps Myf-5 mutanter Mäuse nach konditioneller Geninaktivierung

Abstract

In den letzten Jahren wurden in mehreren Labors verschiedene Mausstämme mit Nullmutationen des für einen myogenen Transkriptionsfaktor kodierenden Myf-Gens (Myogenic factor 5) generiert. Die Abwesenheit von Myf-5-Protein im sich entwickelnden Mausembryo führt zu einer Verzögerung der Myotombildung von 1,75 Tagen, bis die myogene Aktivität der einsetzenden MyoD-Expression benötigte Muskelvorläuferzellen determiniert. Die Muskulatur homozygoter Myf5-Mutanten entwickelt sich überraschenderweise normal. Die Abwesenheit des myogenen Myf5-Proteins führt unerwartet zum Fehlen distaler Rippen, in dessen Folge die Mäuse perinatal aufgrund mangelnder Respiration sterben. Um die Funktion von Myf-5 in adulten Mäusen zu untersuchen, wurde eine Mauslinie generiert, die mit Hilfe der Cre/loxP-Technologie ein konditional inaktivierbares Allel trägt (Myf-5loxP). Die kontrollierte Expression der Cre-Rekombinase mit dem Ziel der Inaktivierung des Myf5-Gens (Myf-5ΔloxP) wurde in 4 verschiedenen Ansätzen verfolgt. (1) Zeitliche Kontrolle der Exzision durch den induzierbaren Mx-Promotor. (2) Ausschließlich auf Skelettmuskulatur beschränkte Cre-Rekombinase-Expression durch den muskelspezifischen Muskel-Creatin-Kinase-Promotor. (3) Durch Adenovirus vermittelte Cre-Rekombinase-Expression, um unabhängig von verfügbaren Promotoren und ihren Expressionsprofilen zu sein. (4) Konstitutive Cre-Rekombinase Expression in einer Cre-deleter Mauslinie zwecks frühestmöglicher Myf5-Inaktivierung. Die Myf5-Exzision im Zygotenstadium sollte eine Phänokopie der alten Myf5-Allele darstellen. Homozygote Myf-5ΔloxP/ΔloxP Mutanten zeigen unerwartet keine Fehlentwicklung der Rippen. Trotz des völligen Fehlens der frühen Myotomentwicklung sind die Mutanten lebensfähig und fruchtbar, sie weisen keine erhöhte Sterblichkeit auf. Daraus kann geschlossen werden, dass der zuvor für Myf5 mutante Tiere beschriebene Rippenphänotyp durch Missregulation eines noch unbekannten Gens verursacht wird. Der Schwanz von Myf-5ΔloxP/ΔloxPMäusen weist mit einsetzender Adoleszenz auffällige Unterschiede im Vergleich mit dem Wildtyp oder heterozygoten Tieren eines Wurfs auf. Der Schwanz wird im ersten Lebensmonat spannungslos und beinahe immobil, da ihm ein Großteil der knorpeligen Stützelemente fehlt. Dagegen ist die Muskulatur in mutanten Tieren morphologisch nicht auffällig, jedoch weisen alle Myf5-homozygoten Mäuse mit zunehmendem Alter eine buckelige Körperhaltung auf. Die meisten Myf-5ΔloxP/ΔloxP Mutanten entwickeln zusätzlich motorische Auffälligkeiten im Gang. Diese beiden Phänomene werden häufig im Zusammenhang mit Muskelinsuffizienzen beobachtet. Eine parallele Strategie die normale Rippenentwicklung in Myf5mutanten Mausembryonen zu gewährleisten, basiert auf der Insertion der für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-6 (FGF6) kodierenden cDNS in den Myf5-Lokus. Das vom Myf5-Promotor exprimierte FGF6 sollte die Induktion des Rippenblastems vermitteln. Homozygote Träger dieser FGF-6-Knock-in-Mutation weisen einen unauffälligen Brustkorb bei der Geburt auf, sterben jedoch aus noch ungeklärter Ursache direkt nach der Geburt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei neue Mauslinien mit Mutationen des Myf5-Lokus analysiert, die nicht zum vormals beschriebenen Rippenphänotyp führen. Die Myf5ΔloxP/ΔloxP Mauslinie mit einer 3 Kilobasen großen Exzision im Myf5-Lokus ist lebensfähig. Ein neuer Weg für die eingehendere Untersuchung der Muskelentwicklung und Regeneration in adulten Stadien wurde geöffnet.

In recent years different laboratories generated mutations of the gene coding for the transcription factor Myf5 (myogenic factor 5). Insertion of a PGK-neo selection cassette into the coding region destroys the open reading frame. The absence of myogenic regulatory factor Myf-5 leads to a delay of 2.5 days in myotome formation, until the expression of transcription factor MyoD rescues myogenic activity. While the musculature in homozygous Myf5 mutant animals develops normally, they die perinatally due to the absence of the distal portion of ribs leading to respirative failure. To investigate the role of Myf-5 in adult mice a conditional allele of the Myf5 gene using Cre/loxP technology (Myf5loxP) has been generated. Surprisingly, if Myf5 was excised at the zygote stage (now referred to as Myf5ΔloxP), homozygous mice did not show malformations of the ribs. Despite a complete loss of early myotome formation, mutants were viable and fertile and showed no increased mortality. This data leads to the suggestion that the rib phenotype in previously described Myf5-mutant mice is caused by long distance effects on a yet unknown gene. While the musculature of Myf5ΔloxP/ΔloxP mice appears normal, the tail shows striking differences compared to the tail of wildtype or heterozygous littermates. At the age of weaning the tail of homozygous animals displays a lack of tension and becomes nearly immobile. Histological analysis revealed that the number of cartilaginous elements in the tail is severely reduced, while the musculature is unaffected. With increasing age, most Myf5-homozygous mice showed a hunchback-like abnormal posture and most mice developed gait disturbances. Another approach to rescue the rib phenotype of Myf5-mutant mice is the insertion of a FGF6-cDNA into the Myf5-locus. FGF6 is expected to induce the rib blastema when driven by the Myf5-promoter. Homozygous offspring carrying this FGF6-Knock-in-allele showed a normal ribcage but died shortly after birth for a yet unknown reason. Two new mouse strains were generated carrying mutations in the Myf5-locus. Both mutations exerted no rib phenotype. Only the strain with an excised DNA portion of 3 kb containing the basal promoter and the first exon of Myf5 is viable and fertile. A new path for the examination of myogenesis in embryos and muscle regeneration in adult mice was opened.