Dynamics and functional apsects of histone modifications in plants

Abstract

Zur Analyse potentiell zellzyklusabhängiger bzw. entwicklungsspezifischer dynamischer Veränderungen von Chromatinmodifikationen wurde ein Versuchsansatz für Pflanzen entwickelt. Dabei werden in entsprechend ihrem DNA-Gehalt flowsortierten Kernen Chromatinmodifikationen, Replikations- und Transkriptionvorgänge immunocytologisch detektiert und die betroffenen Chromatindomänen (Eu- und Heterochromatin) mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung markiert. Eu- and Heterochromatin wiesen während der Replikation die stärkste Acetylierung im Histon H4 auf. Im Heterochromatin wird anschließend H4 bis zur Mitose unter das Niveau von Euchromatin deacetyliert. Diese evolutionäre konservierte replikationsabhängige Acetylierung ist wahrscheinlich für die Maintenance-DNA-Methylierung und die ubiquitäre Postreplikationsreparatur erforderlich und überdeckt die feinabgestimmte Acetylierung in transkriptionsaktiven Promotorregionen. Mit Hilfe von Arabidopsis-Mutanten, die in der Maintenance-Methylierung der DNA (ddm1, met1) bzw. der Methylierung der Lysinrestes 9 von Histon H3 (kyp) defekt sind, wurde die Beziehung zwischen der Maintenance-DNA-Methylierung an CpG-Orten, der Methylierung von H3K9 und der Heterochromatinausprägung untersucht. Es wurde gezeigt, dass CpG-Methylierung für die Heterochromatinausprägung erforderlich ist und die Dimethylierung von H3K9 im Heterochromatin gesteuert. Das Fehlen der H3K9-spezifischen Histonmethylase KYP beeinflusst die CpG-Methylierung nich nachweisbar und fehlende Dimethylierung von H3K9 hat keinen Einfluss auf die Ausprägung von konstitutiven Heterochromatin in Arabidopsis.

A novel approach combining immunodetection of target proteins, freshly replicated DNA (BrdU-labelled), nascent RNA molecules (BrUTP-labelled), and fluorescent in situ hybridisation (FISH) in plant cell nuclei flow-sorted based on their DNA content allowed to follow the cell cycle dynamics of chromatin modifications. A pronounced modulation of histone acetylation was detected at the level of large chromatin domains (euchromatin, heterochromatin, nucleoli) in plants. Heterochromatin, being hypoacetylated during the most of interphase became strongly acetylated during its replication time in late S and deacetylated again towards mitosis. Also euchromatin showed increased levels of histone acetylation during S-phase. This evolutionarily conserved global replication-dependent acetylation, masking fine-tuned acetylation of transcriptionally promoters, is probably required for post-replicative DNA repair and DNA maintenance methylation. Using Arabidopsis mutants with defects in DNA methylation (met1, ddm1) and H3K9 methylation (kyp) allowed to elucidate the relationship between DNA maintenance (CpG) methylation and H3K9 methylation during post-replicative heterochromatin re-assembly. Heterochromatic chromocenters, smaller in both DNA hypomethylation mutants due to the dispersion of pericentromeric sequences, revealed decreased levels of DNA and H3K9 dimethylation. In kyp, chromocenters lacking high levels of H3 dimethylK9, were of wild-type appearance and contained high levels of DNA methylation. These data suggest that the absence of KYP histone methyltransferase does not affect CpG-methylation, and in contrast to CpG-methylated repeats, dimethylated H3K9 is dispensable for proper formation and maintenance of constitutive heterochromatin in Arabidopsis.