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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3396
Title: Lokale Änderungen der Struktur und ihr Einfluss auf die Stabilität und Faltung von Ribonuklease A
Author(s): Köditz, Jens
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2004
Extent: Online-Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000006337
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Stabilität und Faltung von RNase A und ihrer proteolyseresistenteren Variante A20P-RNase A in Trifluorethanol (TFE) untersucht. Neben der Charakterisierung der Proteine durch spektroskopische Methoden wurde die Methode der limitierten Proteolyse zur Detektion lokaler Strukturänderungen und zur Bestimmung von Geschwindigkeitskonstanten der Entfaltung genutzt. Hierbei wurde in TFE-Konzentrationen bis 20 % (v/v) eine Abnahme der Flexibilität der loop-Region um Ala20 mittels limitierter Proteolyse beobachtet, die auf die Stabilisierung der diese Region umgebenden Helices durch TFE im nativen Protein zurückgeführt wurde. Neben der Charakterisierung des thermodynamischen Gleichgewichts wurden für RNase A und A20P-RNase A erstmalig die Entfaltungs- und Rückfaltungsreaktionen in TFE mittels stopped-flow Spektroskopie untersucht. Diese Untersuchungen wurden durch die Methode der limitierten Proteolyse zur Bestimmung von Entfaltungskonstanten in TFE-Konzentrationen zwischen 0 - 45 % (v/v) ergänzt. Die Bestimmung von Entfaltungskonstanten unter nativen und nativ-ähnlichen Bedingungen führte zur Identifizierung einer nativ-ähnlichen Spezies. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das in der Gruppe entwickelte Modell der Entfaltungsregion mittels Mutationsstudien verifiziert werden. Dazu wurde der Einfluss von Mutationen in zwei proteolytisch sensitiven Regionen von RNase A auf die thermodynamische Stabilität des Enzyms untersucht. Bei diesen Regionen handelt es sich einerseits um die loop-Region um Ala20, die schon unter nativen Bedingungen für die unspezifischen Proteasen Subtilisin Carlsberg, Proteinase K und Elastase proteolytisch zugänglich ist und andererseits um die Region Lys31 - Phe46, die als sogenannte Entfaltungsregion identifiziert wurde und unter denaturierenden Bedingungen als erste proteolytisch zugänglich wird. Während Mutationen in der Region um Ala20 kaum einen Einfluss auf die thermodynamische Gesamtstabilität von RNase A hat, führten die Mutationen in der postulierten Entfaltungsregion zu einer drastischen Destabilisierung des Gesamtmoleküls. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen zeigen, dass die Region Lys31 - Phe46 einen beträchtlichen Beitrag zur Gesamtstabilität des Proteinmoleküls beisteuert und unterstützen damit das Modell der Entfaltungsregion.
In the first part of this work, the stability and folding of RNase A and its proteolytically more resistant variant A20P-RNase A was investigated in trifluoroethanol (TFE). In addition to the characterization of the proteins by spectroscopy the method of limited proteolysis was used to detect local structural changes and to determine rate constants of unfolding. In TFE concentrations up to 20 % (v/v), a decrease in flexibility of the loop-region around Ala20 was observed by limited proteolysis. This finding was attributed to a stabilization of the helices surrounding the loop-region by TFE. In addition to the characterization of the thermodynamic equilibrium unfolding and refolding reactions of RNase A and A20P-RNase A in TFE were investigated by stopped flow spectroscopy. These investigations were completed by limited proteolysis to determine unfolding rate constants in 0 - 45 % (v/v) TFE. The determination of the rate constants of unfolding under native and native-like conditions led to the identification of a native-like state. In the second part of this work, the model of the unfolding region developed in our group should be verified by mutational studies. For this purpose, the influence of mutations in two proteolytically sensitive regions of RNase A on the thermodynamic stability of the enzyme was investigated: the loop region around Ala20, which is attacked by the unspecific proteases subtilisin Carlsberg, proteinase K, and elastase even under native conditions and the region from Lys31 to Phe46, that was identified as the so-called unfolding region and becomes as first proteolytically accessible under denaturing conditions. While mutations in the region around Ala20 hardly influenced the thermodynamic stability of the RNase A, the mutations in the postulated unfolding region led to a drastic destabilization of the entire molecule. The results of our investigations show that the region Lys31-Phe46 contributes considerably to the stability of the entire protein molecule and support the model of the unfolding region.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/10181
http://dx.doi.org/10.25673/3396
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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