Isoprenoidbiosynthese in mykorrhizierten Maiswurzeln: Klonierung, Charakterisierung und Lokalisierung einer 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (DXR)

Abstract

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen die Klonierung, Charakterisierung und Lokalisierung einer 1-Desoxy-d-xylulose-5-phsophat-Reduktoisomerase (DXR), eines Enzyms des plastidären Methylerythritolphosphat-Wegs der Isoprenoidbiosynthese, aus Zea mays. Bisherige Untersuchungen hatten eine erhöhte Transkriptakkumulation eines DXR-Gens in Maiswurzeln im Laufe der Kolonisierung durch arbuskuläre Mykorrhizapilze gezeigt, die mit der Akkumulation von Apocarotinoiden in den kolonisierten Wurzeln einhergeht. Nach der Klonierung einer DXR-ähnlichen cDNA wurde die enzymatische Funktion des kodierten Proteins durch funktionelle heterologe Expression bestätigt. Weiterhin wurde das rekombinante Protein als Antigen zur Erzeugung eines polyklonalen Antiserums eingesetzt. Im Expressionsprofil zeigte sich zum einen die erhöhte Transkriptakkumulation von ZmDXR in mykorrhizierten Wurzeln, zum anderen waren sehr grosse Transkriptmengen auch in photosynthetisch aktiven Blättern nachweisbar. Durch Einsatz des affinitätsgereinigten Antiserums konnte die differentielle Akkumulation von ZmDXR in Maiswurzeln auch auf Proteinebene bestätigt werden. Um ein detaillierteres Bild von der räumlichen Verteilung des Proteins in Maiswurzeln zu gewinnen, wurden Immunlokalisierungsstudien durchgeführt. Dabei zeigte sich eine differentielle Lokalisation des Proteins, die vom Kolonisierungsstatus der jeweiligen Zellen abhängig ist. Während in arbuskelfreien Zellen die DXR in einzelnen Plastiden im Cytoplasmasaum bzw. in einer Plastidenaggregation um den Zellkern zu beobachten ist, findet in arbuskelhaltigen Zellen eine deutliche Vermehrung und räumliche Umverteilung der Plastiden statt. Abhängig vom Entwicklungsstadium der Arbuskel kommt es zur Ausbildung eines plastidären Netzwerkes in unmittelbarer Nähe zu dem pilzlichen Organ. Die Bedeutung der Induktion des MEP-Weges bzw. der Akkumulation der Apocarotinoide für die arbuskuläre Mykorrhiza ist allerdings weiterhin unklar.

The main topics of the work described here were the cloning, characterization and localization of a 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) from the methylerythritol phosphate pathway in isoprenoid biosynthesis in Zea mays. Previous investigations had shown an increase in DXR transcript accumulation in maize roots upon colonization by arbuscular mycorrhizal fungi, concomitant with the accumulation of apocarotenoids. After cloning of a DXR-like cDNA, the enzymatic function of the encoded protein could be demonstrated by functional heterologous expression. The recombinant protein was also used as antigen for the production of a polyclonal antiserum. The expression profile confirmed an increased transcript accumulation of ZmDXR in mycorrhizal roots and showed high amounts of transcripts also in photosynthetic leaves. Using the affinity-purified antiserum, the differential accumulation of ZmDXR in maize roots could also be verified on the protein level. To obtain a more detailed picture of DXR distribution in maize roots, immunolocalization studies were performed. in non-colonized cells, DXR is located in single plastids in the cytoplasm layer or in a plastid aggregation around the nucleus, respectively. In colonized cells, plastids multiply and are rearranged spatially. Depending on the developmental stage of the arbuscule, a plastidial network is formed that is tightly surrounding the fungal organ. The functional significance of the induction of the MEP pathway or the accumulation of the apocarotenoids in arbuscular mycorrhiza remains unclear.