Untersuchungen zum Einfluß freier Fettsäuren und Öle auf in vitro kultivierte Keratinozyten

Abstract

In unseren Untersuchungen betrachteten wir unterschiedliche Aspekte des Einflusses freier Fettsäuren (FFA) und Öle auf HaCaT-Keratinozyten. Wir führten Versuche zur Aufnahme von FFA, Membranpermeabilisierung, zum Einfluß auf die Konzentration intrazellulären freien Calciums und zur Induktion von Apoptose durch. Die Aufnahmestudien wurden unter Verwendung von Parinarsäure (PA) an einzelnen Zellen mit einem Laser Scanning Mikroskop (LSM) durchgeführt. PA wurde innerhalb weniger Minuten in die Zellmembran aufgenommen und auf intrazelluläre Membransysteme weiterverteilt. Ungesättigte FFA führten zu Permeabilisierung der Zellmembran. Diese wurde gemessen, indem die Zellen mit Cell Tracker Orange (Farbstoff auf Fluoreszeinbasis) angefärbt wurden und dem Außenmedium 6-Carboxyfluorescein (6-CF) zugesetzt wurde. Wurde die Membran durch die Applikation ungesättigter FFA gestört, konnte 6-CF in die Zelle eindringen, es kam zur lokalen Mischung von 6-CF und Cell Tracker Orange. Bei Anregung des 6-CF führte dessen Emission zur Anregung des Fluoreszeins und es konnte erstmalig eine Emission >540nm gemessen werden. Im weiteren Verlauf kam es auch zu lokalen Membranrupturen, sichtbar als Auslaufen des Zytoplasmas. Änderungen von intrazellulären Konzentrationen freien Calciums wurden mit dem LSM unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen gemessen. Wir beobachteten, daß die Inkubation mit ungesättigten FFA einen Anstieg der intrazellulären Konzentration freien Calciums nach sich zieht, der von der Konzentration der FFA abhängig ist. Gesättigte FFA, ein physiologisches Gemisch von FFA und Öle bewirkten allenfalls eine geringe und nicht signifikante Steigerung der intrazellulären Calciumkonzentration. Messungen zur Apoptoseinduktion wurden mittels Annexin V- FITC-Bindung und Kernpyknosebestimmung durchgeführt. Ungesättigte FFA, aber weder gesättigte FFA, ein physiologisches Gemisch von FFA oder Öle, induzierten eine Apoptose der Keratinozyten in Abhängigkeit von der Konzentration der FFA.

In our studies we looked at different aspects of the influence of free fatty acids (FFA) and oils on HaCaT-keratinocytes. We investigated the incorporation of FFA, membrane permeabilization, influence on the concentration of intracellular free calcium and induction of apoptosis. Uptake studies were carried out using parinaric acid (PA) on single cells with a Laser Scanning Microscope (LSM). PA was taken up into the cell membrane in few minutes and than distributed to intracellular membrane systems. Unsaturated FFA caused local membrane ruptures, visible as pouring of cytoplasm out of the cells. A preceding membrane permeabilization was detected by differential dying of the outside media with 6-Carboxyfluorescein (6-CF) and the cells with Cell Tracker Orange (a fluorescent dye based on fluorescein). If the cell membrane was disturbed by unsaturated FFA, 6-CF entered the cells and the emission of the excitated 6-CF excited the fluorescein and an emission at >540nm was detected for the first time. Changes of the intracellular concentrations of free calcium were measured by fluorescence indicators (Fluo 3/ Fura Red). We found, that incubation with unsaturated FFA causes an increase in intracellular free calcium in a concentration dependent manner. Saturated FFA, a physiological mixture of FFA and plant oils caused at the most a very slight and not significant raise in intracellular free calcium. Studies of induction of apoptosis were carried out using Annexin V-FITC bonding and measurements of karyopyknosis. Unsaturated FFA, but neither saturated FFA, a physiological mixture of FFA nor plant oils, were able to induce apoptosis in a concentration dependent manner.