Untersuchungen zur Struktur und zum Katalysemechanismus der Indolpyruvatdecarboxylase aus Enterobacter cloacae

Abstract

Die Thiamindiphosphat-abhängige Indolpyruvatdecarboxylase stellt in Enterobacter cloacae (EcIPDC) das Schlüsselenzym in der Biosynthese des Phytohormons Indolessigsäure dar und katalysiert die nichtoxidative Decarboxylierung von Indolpyruvat zu Indolacetaldehyd und Kohlendioxid. Neben dem physiologischen Substrat werden auch Pyruvat und Benzoylformiat umgesetzt. Röntgenkleinwinkelstreuexperimente mit Synchrotonstrahlung zeigten, dass das Apoenzym der EcIPDC ein pH-abhängiges Gleichgewicht zwischen Tetrameren und Dimeren bei niedrigen pH-Werten bzw. zwischen Dimeren und Monomeren bei höheren pH-Werten aufweist. Der Zusatz von Thiamindiphosphat resultiert in der Stabilisierung der tetrameren Form der EcIPDC. Die Kristallstruktur des Holoenzyms der EcIPDC wurde mit einer Auflösung von 2.65 Å bestimmt. Die Röntgenkristallstrukturanalyse zeigte, dass die homotetramere EcIPDC in ihrem Aufbau besonders den Thiamindiphosphat-abhängigen Pyruvatdecarboxylasen ähnelt. Die innerhalb der Klasse der Indolpyruvatdecarboxylasen und der Pyruvatdecarboxylasen hoch konservierten Aminosäurereste Asp29, Glu52, His115 und Glu468 (Nummerierung entsprechend EcIPDC) sind in der Nähe des Reaktionszentrums gelegen und können im Sinne ihrer Säure-Base-Eigenschaften einen Einfluss auf bestimmte Katalyseschritte nehmen. Ein wichtiger Unterschied in den aktiven Zentren von EcIPDC und PDC ist Gln383, welches in den Pyruvatdecarboxylasen durch ein Threonin ersetzt ist. Kinetische Untersuchungen und der 1H-NMR-spektroskopische Nachweis der in der Katalyse von Indolpyruvat, Pyruvat und Benzoylformiat gebildeten Reaktionsintermediate spezifisch konstruierter Aminosäureaustauschvarianten (Asp29Glu, Glu52Asp, His115Lys, Gln383Thr und Glu468Asp) dienten zur Identifizierung der an der Katalyse beteiligten Aminosäureseitenketten und funktionellen Gruppen des Cofaktors. Aufgrund der Verteilung der Intermediate im steady-state konnten mikroskopische Geschwindigkeitskonstanten einzelner Katalyseschritte berechnet werden. In der EcIPDC-Katalyse sind die kovalente Substratbindung und die Produktabspaltung partiell geschwindigkeitsbestimmend. Die Decarboxylierungsreaktion ist dagegen mindestens um eine Größenordnung schneller. Die Analyse 4-substituierter Benzoylformiate zeigte, dass die elektronischen Anforderungen der Substituenten die Stabilität der während der Katalyse gebildeten Intermediate beeinflussen. Die strukturellen und kinetischen Ergebnisse wurden zusammenhängend diskutiert und vergleichend zu verwandten Thiamindiphosphat-abhängigen Enzymen analysiert. Dabei unterstützen und erweitern die präsentierten Ergebnisse die vorgeschlagenen Reaktionsmechanismen der Benzoylformiatdecarboxylase und der Pyruvatdecarboxylase, sowie die Modellstudien relevanter Schlüsselintermediate.

The thiamin diphosphate-dependent enzyme indolepyruvate decarboxylase from Enterobacter cloacae (EcIPDC) catalyzes the non-oxidative decarboxylation of indolepyruvate to indoleacetaldehyde and carbon dioxide, one step in the indolepyruvate pathway of biosynthesis of the plant hormone indoleacetic acid. Besides the physiological substrate also alternative substrates like pyruvate and benzoylformate are converted. Small angle X-ray solution scattering experiments suggested a pH-dependent subunit association equilibrium for the apoenzyme. At lower pH values the tetrameric and dimeric forms of EcIPDC are predominant, at higher pH values dimers even dissociate into monomers. Cofactors stabilize the tetrameric form of the enzyme. The crystal structure of this enzyme has been determined at 2.65 Å resolution. The topology of the active site was found to be similar to that of pyruvate decarboxylase. The active site residues Asp29, Glu52, His115 and Glu468 (EcIPDC numbering) are highly conserved in indolepyruvate and pyruvate decarboxylases and due to their acid-base properties they are able to influence specific steps of catalysis. One major difference between indolepyruvate and pyruvate decarboxylases is Gln383, which is replaced by a threonine residue in pyruvate decarboxylase. The steady state distribution of covalent thiamin diphosphate intermediates of EcIPDC reacting with indolepyruvate and the alternative substrates benzoylformate and pyruvate has been analyzed by 1H-NMR spectroscopy and forward net rate constants of elementary catalytic steps were calculated. As a result the covalent addition of the substrates to the cofactor ylide and the product release were shown to be partially rate-limiting in catalysis of the wild-type enzyme, whereas the rate of decarboxylation of the thiamin diphosphate-substrate adducts is at least one order of magnitude higher. In combination with kinetics, NMR intermediate analysis of specific generated EcIPDC variants (Asp29Glu, Glu52Asp, His115Lys, Gln383Thr und Glu468Asp) was used to assign the involvement of active site side chains and functional groups of the cofactor in distinct catalytic steps. Studies with different para-substituted benzoylformate substrates demonstrate that the chemical reactivity of the substrate affects the stabilisation/destabilisation of specific reaction intermediates. The obtained results are discussed and compared with the properties of related thiamin diphosphate-dependent enzymes and support and extend the recently proposed mechanism of benzoylformate decarboxylase and pyruvate decarboxylase catalysis and model studies on relevant key intermediates.