Rekombinante Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von proBMP-2, BMP-2 und dem BMP-2-Propeptid

Abstract

Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind auto- und parakrin wirkende Cytokine, die in Vertebraten und Invertebraten an der Ausbildung von Körperachsen und Gliedmaßen während der Embryonalentwicklung beteiligt sind. In Vertebraten steuern sie zudem Knochenbildung, -umbau und -regeneration. Sie sind daher von großem medizinischem Interesse. So findet beispielsweise BMP-2 bereits Einsatz als Medikament bei der Behandlung schlecht heilender Schienbeinfrakturen. BMP-2 zählt zu den TGF-β-Familie von Cystin-Knoten-Proteinen und wird als Präproprotein synthetisiert, wobei das aminoterminale Propeptid mehr als doppelt so groß ist wie das eigentliche Cytokin. Trotz dieser Auffälligkeit sind bislang weder die Struktur noch die Funktion des BMP-2-Propeptids, ebensowenig wie die der Propeptide der anderen BMPs geklärt. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals Verfahren für die rekombinante Herstellung eines proBMPs, sowie eines BMP-Propeptids vorgestellt, die die Gewinnung großer Mengen dieser Proteine durch Rückfaltung aus Inclusion Bodies ermöglichen. Dadurch werden künftige in-vivo- und in-vitro-Untersuchungen zu den Funktionen sowie Versuche zur Aufklärung der Struktur der BMP-Propeptide erleichtert. Die ursprüngliche Arbeitshypothese, daß sich durch Verwendung der Pro-Form bei die Renaturierung die Faltunsausbeute von BMP-2 erhöhen läßt, konnte unter den gewählten Bedingungen nicht bestätigt werden. Die Analysen der spektroskopischen Eigenschaften, sowie der thermodynamischen und kinetischen Stabilität der untersuchten BMP-2-Varianten ergaben jedoch Hinweise auf starke Wechselwirkungen zwischen der Propeptid- und der BMP-Domäne von proBMP-2, sowie auf Struktur- und Stabilitätsunterschiede zwischen freiem Propeptid und Propeptiddomäne. Die Eigenschaften des BMP-2-Propeptids ähneln diesbezüglich denen des Propeptids von TGF-β, was für die native Struktur des in vitro renaturierten Proteins spricht. Die spektroskopische Charakterisierung ergab zudem Hinweise auf eine Interaktion der Propeptiddomäne mit einer Rezeptorbindestelle der BMP-Domäne, sodaß auch eine Inhibitorfunktion ähnlich der des TGF-β-Propeptids denkbar ist.

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in the formation of the body axes and limbs in vertebrates and invertebrates. In vertebrates BMPs also regulate bone morphogenesis, remodeling and repair. Hence, they receive attention by developmental biologists as well as by physicians. BMP-2, e.g., is already used for treatment of acute, open tibia shaft fractures. BMP-2 belongs to the TGF-β family of cystine-knot proteins. It is synthesized as a large precursor protein with an N-terminal pro-peptide comprising more than twice as many amino acid residues as the mature growth factor. Despite this fact, neither the structure nor the function of the BMP-2 pro-peptide is known. In this dissertation the recombinant production of a BMP precursor and of BMP pro-peptide by in vitro refolding from inclusion bodies are introduced for the first time. The original hypothesis that the pro-peptide would assist folding of the cystine-knot moiety could not be confirmed. However, analysis of the spectroscopic properties and the thermodynamic and kinetic stabilities of the BMP-2 variants revealed strong interactions between the pro-domain and the BMP domain, as well as differences in structure and stability between the free pro-peptide and the pro-domain of proBMP-2. In this regard the pro-peptide of BMP-2 resembles the properties of the pro-peptide of TGF-β, supporting the assumption that the pro-peptide and proBMP-2 refolded in vitro possess native structure. Furthermore, the spectroscopic analysis gave indications that the pro-domain interacts with one of the two receptor binding sites of the BMP domain, hence, an inhibitory function of the pro-peptide is cogitable.