Das plastidäre Rieske Fe/S-Protein ; Analyse des Transport- und Assemblierungsprozesses

Abstract

Das plastidäre Rieske Fe/S-Protein ist kerncodiert und wird posttranslationell zur Thylakoidmembran transportiert. In Importversuchen mit isolierten Chloroplasten wird das Rieske-Protein im Gegensatz zu allen anderen bisher untersuchten kerncodierten Thylakoidproteinen im Stroma retardiert. Der anschließende Thylakoidtransport des Rieske-Proteins erfolgt auf dem ΔpH-abhängigen Tat (Twin-arginine translocation)-Weg. Das dafür verantwortliche Rieske-Transportsignal weicht allerdings stark von typischen Tat-spezifischen Signalen ab. Es verfügt nicht über das charakteristische RR-Motiv und wird darüber hinaus nicht proteolytisch entfernt, sondern dient nach dem Transport als Membrananker und ist somit Teil des reifen Proteins. Die Analyse von mutierten und chimären Rieske-Proteinen hat gezeigt, daß für die Retardierung des Proteins im Stroma nicht das ungewöhnliche Transportsignal ausschlaggebend ist, sondern vielmehr die hydrophile, ins Thylakoidlumen exponierte Domäne. So läßt sich diese luminale Domäne nur von Tat-spezifischen Signalpeptiden, nicht jedoch von Sec-Signalen über die Thylakoidmembran transportieren. Da nur die Tat-Translokase in der Lage ist, Proteine im gefalteten Zustand über die Thylakoidmembran zu transportieren, deutet diese Einschränkung der Transportfähigkeit auf eine Faltung der luminalen Domäne im Stroma hin. Diese Hypothese wird durch die nachgewiesene Interaktion des Rieske-Proteins mit dem stromalen Chaperonkomplex Cpn60 sowie mit der Chaperon-ähnlichen Rubisco-Aktivase unterstützt. Im Zuge der Faltung des Rieske-Proteins im Stroma kommt es vermutlich auch zum Einbau des Fe/S-Zentrums, da deutlich wurde, daß der Einbau des Fe/S-Zentrums eine Voraussetzung für die Translokation des Rieske-Proteins über die Thylakoidmembran ist. Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine in Arabidopsis thaliana identifiziert, die potentielle Komponenten der bislang unbekannten plastidären Fe/S-Assemblierungsmaschinerie darstellen. Importversuche zeigten, daß dieser mutmaßlichen Untereinheiten der Fe/S-Assemblierungsmaschinerie ins Stroma der Plastiden importiert werden. Allerdings steht der direkte Nachweis einer Beteiligung dieser potentiellen Assemblierungsproteine am Einbau des Rieske Fe/S-Zentrums noch aus.

The Rieske Fe/S protein is encoded in the nucleus of plant cells and post-translationally transported to the thylakoid membrane of chloroplasts. In contranst to all other nucleus encoded thylakoid proteins analysed so far, transport of the Rieske protein into thylakoids of isolated chloroplasts is retarded within the stroma. Thylakoid translocation of the Rieske protein takes place by the ΔpH-dependent Tat (Twin-arginine translocation) pathway. However, the Tat-targeting signal of the Rieske protein differs from typical Tat-specific signal peptides. It lacks the indicative RR-motif and is furthermore not proteolytically removed after translocation. Instead the signal serves as a membrane anchor and is thus part of the mature protein. Analysis of mutated and chimeric Rieske proteins showed that rather the hydrophilic lumenal domain than the untypical targeting signal is responsible for the retardation of the protein within the stroma. This lumenal domain, which carries the Fe/S cluster can be transported across the thylakoid membrane exclusively by Tat-specific but not by Sec-specific signals. Since only the Tat translocase is capable of transporting folded proteins across the thylakoid membrane, this restriction suggests that the Rieske protein is folded in the stroma prior to thylakoid transport. Indeed, interaction of the Rieske protein with the stromal folding chaperon Cpn60 and the chaperon-like Rubisco activase was observed. It appears likely that in the course of folding also the assembly of the Fe/S cluster takes place. This assumption is supported by the finding that mutations of the Fe/S ligands prevent the translocation of the Rieske protein across the thylakoid membrane. In line with that candidates for subunites of the so far unknown Fe/S assembly machinery in plastids could be identified in the genome of Arabidopsis thaliana. In organello import experimentes showed that these potential Fe/S assembly proteins could be imported into the stroma of isolated chloroplasts, suggest that a stroma-localized Fe/S assembly machinery is operating in plastids. However, final proof that these candidate proteins are indeed involved in the assembly of the Rieske Fe/S cluster is yet missing.