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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3622
Title: Alternative Strategien für die Bekämpfung von Eimeria-Infektionen - spezifische rekombinante Antikörperfragmente sowie Beeinflussung der Kalzium-vermittelten Signaltransduktion
Author(s): Schubert, Ulrike
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2005
Extent: Online-Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000008413
Subjects: Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Die durch Eimeria-Infektionen verursachte Kokzidiose beim Haushuhn stellt ein ernsthaftes Problem in der Geflügelwirtschaft dar, dessen Bekämpfung, u.a. durch die Entwicklung resistenter Parasitenstämme, schwierig und kostenintensiv ist. Es besteht deshalb großer Bedarf für Alternativen in der Therapie und Prophylaxe dieser Erkrankung. Die Penetration von Darmzellen durch Eimeria-Sporozoiten (Invasion) ist die erste Auseinandersetzung zwischen Wirt und Parasit. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Strategien gesucht, um diesen Vorgang zu hemmen. Dabei wurden zwei Wege beschritten: die Isolierung von Antikörperfragmenten zur Neutralisation eines invasionsrelevanten Oberflächenproteins des Parasiten und ein Ansatz auf dem Gebiet der Ca2+-abhängigen Signaltransduktion. Zur Isolierung putativ hemmender Einkettenantikörperfragmente (scFv) wurde eine Phage Display-Antikörperbank eingesetzt, welche auf dem exprimierten Antikörperrepertoir mit Eimeria-Material immunisierter Mäuse basiert. Die Selektion von scFv erfolgte mittels rekombinant exprimiertem Etmic2, einem am Invasionsvorgang der Sporozoiten beteiligten Mikronemenprotein von Eimeria tenella. Bindungstests am fragmentierten Antigen sowie Untersuchungen mittels Biacore-Technologie und kompetitivem ELISA zeigten, dass die erhaltenen anti-Etmic2-scFv unterschiedliche Epitopspezifitäten, relativ geringe Affinitäten und bis auf eine Ausnahme sehr hohe Dissoziationskonstanten aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass in der verwendeten Phage Display-Bank keine hochaffinen scFv gegen Etmic2 vorhanden waren bzw. bei der Immunisierung der Spendertiere keine für Etmic2 spezifischen Antikörper gebildet wurden. Um zu prüfen, ob die an rekombinantem Etmic2 selektierten scFv auch an das native (d.h. aus dem Parasiten stammende) Antigen binden, wurden Sporozoiten- bzw. Oozystenextrakte für Bindungstests mittels ELISA und Immunoblot eingesetzt. Des Weiteren wurde mittels Zellanheftungstest bzw. indirektem Immunfluoreszenztest die Bindung der scFv an Etmic2 auf der Oberfläche von E.tenella-Sporozoiten untersucht. Mit keiner der verwendeten Methoden ließ sich eine Bindung an natives Etmic2 nachweisen. Dies legt nahe, dass die Antikörper nur an die rekombinante Form des Antigens binden. Zum Vergleich der Epitopspezifitäten von anti-Etmic2-scFv und einem Kaninchenserum gegen natives Etmic2 wurde ein kompetitiver ELISA durchgeführt, bei dem keine Verdrängung der scFv vom immobilisierten rekombinanten Etmic2 durch Serumantikörper festzustellen war. Man kann deshalb davon ausgehen, daß sich die Hauptepitopspezifitäten der Serumantikörper von den Spezifitäten der scFv unterscheiden und beim nativen bzw. rekombinanten Etmic2 also unterschiedliche Epitope zugänglich sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines in vitro-Testsystems und dem Einsatz der Durchflußzytometrie untersucht, ob und inwieweit extrazellulärer Ca2+-Mangel oder Stoffe, welche einen Wirkung auf die Ca2+-abhängige Signaltransduktion besitzen, die Invasion von E.tenella-Sporozoiten beeinflussen. Diese Untersuchungen hatten zum Ziel, für die Invasion essentielle Bedingungen und mögliche neue Wirkstoffe gegen Eimeria-Infektionen zu identifizieren: Bei der Verwendung verschiedener Ca2+-Konzentrationen im Medium zeigte sich eine starke Abhängigkeit der Sporozoiteninvasion von extrazellulärem Ca2+. Dabei wurde eine maximale Hemmung von 70 % beobachtet. Der halbmaximale Effekt trat bereits bei einer noch relativ hohen Ca2+-Konzentration von etwa 600 µM auf. Durch die Vorinkubation von Sporozoiten in Medium +/- Ca2+ wurde im anschließenden Sporozoiten-Invasionshemmtest gezeigt, daß der hemmende Effekt bei Ca2+-Mangel durch Beeinflussung der Parasiten zustande kommt. Wie verschiedene Viabilitätstests mit +/-Ca2+ inkubierten Sporozoiten zeigten, beruht der invasionshemmende Effekt bei Ca2+-Mangel wahrscheinlich nicht auf einer verringerten Lebensfähigkeit des Parasiten. Des Weiteren wurden verschiedene Wirkstoffe, welche Ca2+-Signalvorgänge in Eukaryoten beeinflussen, im Sporozoiten-Invasionshemmtest eingesetzt. Dabei hatte Koffein, das bis zu einer Konzentration von 250 µM eingesetzt wurde, keinen Effekt, während durch Ryanodin und 2-APB die Infektionsrate herabgesetzt wurde. Vorinkubationsversuche zeigten, daß 2-APB dabei wahrscheinlich die Wirtszellen beeinflußt und Ryanodin auf die Sporozoiten wirkt. Letzteres wurde durch die Färbung mit einem fluoreszierenden Ryanodinderivat bestätigt, mit welchem sich eine spezifische Bindung an Sporozoiten nachweisen ließ. Die Kombination von Ca2+-armem Medium und Ryanodin hatte einen additiven Effekt auf die Sporozoiten-Invasion in vitro. Man kann deshalb davon ausgehen, daß die Mechanismen, über welche Ryanodin und der Mangel an extrazellulärem Ca2+ die Invasion hemmen, voneinander unabhängig sind. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die essentielle Bedeutung von extrazellulärem Ca2+ für die Invasion von Eimeria-Sporozoiten beschrieben. Des weiteren wurde Ryanodin aufgrund seiner spezifischen Bindung an Sporozoiten und der invasionshemmenden Wirkung als ein möglicher neuer Wirkstoff gegen Eimeria-Infektionen identifiziert.
Coccidiosis caused by Eimeria infections in chickens is a constant threat in poultry production. Therapy and prophylaxis are difficult and costly which among other reasons is due to the development of resistant parasite strains. Hence there is a strong need for alternative approaches. Penetration of intestinal cells by Eimeria sporozoites (invasion) is the first confrontation between host and parasite. New strategies for inhibition of this process were subject of this work. Two approaches were used: isolation of antibody fragments binding to surface antigens essential for invasion and investigations in the field of calcium signalling. Source for isolation of putative inhibitory single chain antibody fragments (scFv) was a phage display library based on mice immunized with Eimeria material. Selection of scFv was performed with recombinant Etmic2, an Eimeria tenella microneme protein involved in invasion. Binding tests using fragmented antigen as well as examinations by Biacore technique and competitive ELISA revealed that the isolated scFv show different epitope specificities, low affinities and, apart from one exception, very high dissociation constants. These results suggest that no highly affine binders to Etmic2 were present in the employed library and/or there was no immune response specific for Etmic2 in the donor animals. To check if scFv selected at recombinant Etmic2 did also bind to the native form of the antigen (isolated from the parasite), sporozoite and oocyst extracts were used for ELISA and immunoblot binding tests. Moreover binding of scFv to Etmic2 at the surface of E.tenella sporozoites was examined by cell adherence test and indirect immunofluorescent antibody test. None of the applied methods demonstrated any binding to native Etmic2. Epitope specificities of anti-Etmic2-scFv and serum derived from rabbits immunized with native Etmic2 were compared in a competitive ELISA. Since no suppression of scFv binding to recombinant Etmic2 by serum antibodies was observed, in all probability main specificities of serum antibodies and specificities of scFv are different and on recombinant and native Etmic2 dissimilar epitopes are accessible. In the second part of this work an in vitro assay system linked with analysis via FACS was applied to study the effects of calcium deficiency and compounds known to affect calcium signalling on E.tenella sporozoite invasion. Aim of these investigations was the identification of conditions essential for invasion and of new antagonists to Eimeria infections: Application of different calcium concentrations in the culture medium revealed that sporozoite invasion is remarkably dependent on extracellular calcium. Maximum inhibition observed was 70 %. A concentration of 600 µM calcium which is relatively high resulted in half of that effect. Preincubation of sporozoites with medium +/- calcium before invasion assay demonstrated that inhibition by calcium deficiency is due to effects on the parasites. Various viability tests on sporozoites preincubated with +/- calcium indicated that inhibition by calcium deficiency is not based on a decrease of viability of the parasites. Additionally several compounds known to affect calcium signalling of eucaryotic cells were tested by sporozoite invasion assay. Thereby caffeine, used in concentrations up to 250 µM, showed no effect but infection rate was decreased by ryanodine and 2-APB. Preincubation tests demonstrated that 2-APB thereby acts on host cells whereas ryanodine affected sporozoites. The latter was assured by staining with a fluorescent ryanodine derivative which gave evidence for a specific binding to sporozoites. Combination of a calcium deficient medium and ryanodine resulted in an addition of both inhibitory effects suggesting that both modes of action are unrelated. This is the first description of the essential importance of extracellular calcium for Eimeria sporozoite invasion. Moreover ryanodine was identified to specificly bind to sporozoites and to impair their capability to invade host cells. These properties might enable ryanodine to be applied as a new anticoccidium.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/10407
http://dx.doi.org/10.25673/3622
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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