Molekulare Analyse der Gene und Proteine der Cytochrom P450-haltigen Morpholin-Monooxygenase aus Mycobacterium sp. Stamm HE5

Abstract

Ein Cytochrom P450 (P450mor) und ein Ferredoxin (Fdmor), die beim Wachstum von Mycobacterium sp. Stamm HE5 auf Morpholin spezifisch induziert vorlagen, wurden bis zur Homogenität gereinigt. Es wurde angenommen, dass P450mor und Fdmor Komponenten einer P450-haltigen Monooygenase sind, welche die Hydroxylierung von Morpholin katalysiert. Da eine Morpholin-abhängige Enzymaktivität nicht zu messen war, wurden im Verlauf der Reinigung indirekte Methoden zur Detektion dieser Proteine eingesetzt. Ausgehend von den teilweise bestimmten Aminosäuresequenzen von P450mor und Fdmor, wurde das entsprechende morABC Operon kloniert und sequenziert. Die Gene morA und morB kodieren für P450mor beziehungsweise Fdmor. Es wurde gezeigt, dass morC für die spezifische Ferredoxin-Reduktase (FdRmor) dieser Monooxgenase kodiert. Diese konnte zuvor als Protein nicht identifiziert werden. Die Gene morA, morB und morC waren identisch mit den bereits bekannten mor Genen aus Mycobacterium Stamm RP1. In dieser Arbeit wurden nahezu identische mor Gene auch in Mycobacterium chlorophenolicum identifiziert, was auf einen horizontalen Gentransfer hindeutete. Deutliche Unterschiede wurden in den Genregionen stromabwärts von morC gefunden. Das rekombinante Protein FdRmor wurde als eine strikt NADH-abhängige, FAD-haltige Reduktase charakterisiert. Für rekombinantes Fdmor wurde gezeigt, dass dieses einen Fe3S4-Cluster trägt. Kinetische Untersuchungen des Redoxpaares FdRmor/Fdmor ergaben, im Vergleich zur Reduktion von Cytochrom c, eine Präferenz für die Reduktion von Nitroblautetrazolium (NBT), welche auch nur mit Fdmor möglich war. Der geringe Km-Wert von FdRmor für Fdmor, gemessen mit NBT, wies auf eine hohe Spezifität hin. Die zusätzlichen Aminosäuresequenzen in His-Tag Fusionsproteinen von Fdmor änderten die kinetischen Parameter nicht signifikant, führten aber zu kompetitiven Hintergrundaktivitäten dieser Proteine. Die Darstellung von P450mor als N-terminales His-Tag Fusionsprotein ermöglichte die Reinigung dieses Proteins in seiner aktiven Form, was zuvor mit Wild-Typ P450mor nicht gelungen war. Mit dem wahrscheinlichen Substrat Morpholin konnte für P450mor kein Substratbindungsspektrum nachgewiesen werden, jedoch generierten verschiedene Azolverbindungen Bindungsspektren vom Typ II. Die für diese Substanzen gemessenen Kd-Werte führten zu der Annahme, dass P450mor eine Präferenz für größere und/oder hydrophobere Moleküle haben könnte. Mit den gereinigten rekombinanten Proteinen P450mor, Fdmor und FdRmor wurde die homologe P450-haltige Monooxygenase rekonstitutiert, für die der Umsatz von Morpholin gezeigt werden konnte.

A cytochrome P450 (P450mor) and a ferredoxin (Fdmor), whose expression was specifically induced during growth of Mycobacterium sp. strain HE5 on morpholine, were purified to homogeneity. P450mor and Fdmor were supposed to form part of a P450-containing monooxygenase catalysing the hydroxylation of morpholine. Due to the lack of enzymatic activity, indirect methods were used to detect these proteins during purification. Proceeding from the partially determined amino acid sequences of P450mor and Fdmor, the corresponding morABC operon was cloned and sequenced. The genes morA and morB encoded P450mor and Fdmor, respectively. It was shown that morC encodes the specific ferredoxin-reductase (FdRmor) of this monooxygenase, which could not be identified as protein previously. The genes morA, morB, and morC were identical to the already known mor genes from Mycobacterium strain RP1. In this work almost identical mor genes were also identified in Mycobacterium chlorophenolicum pointing to a horizontal gene transfer. Pronounced differences were found in the gene regions downstream of morC. The recombinant protein FdRmor was characterized as a strictly NADH-dependent, FAD-containing reductase. Recombinant Fdmor was shown to contain a Fe3S4 cluster. Kinetic investigations of the redox couple FdRmor/Fdmor revealed a preference for the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) and an absolute requirement for Fdmor in this reaction, compared with the reduction of cytochrome c. The quite low Km of FdRmor for Fdmor, measured with NBT, indicated high specificity. The addition of sequences providing His-Tags to the N- or C-terminus of Fdmor did not significantly alter kinetic parameters, but led to competitive background activities of these proteins. Production of P450mor as N-terminal His-Tag fusion protein enabled the purification of this protein in its active form, which was previously not possible for wild-type P450mor. The proposed substrate morpholine failed to produce a substrate-binding spectrum for P450mor, but different azole compounds generated type II binding spectra and the determined Kd values for these substances suggested that P450mor might have a preference for more bulky and/or hydrophobic molecules. The purified recombinant proteins FdRmor, Fdmor and P450mor were used to reconstitute the homologous P450-containing monooxygenase, which was shown to convert morpholine.