Charaktierisierung und Funktion von CYP74-Enzymen in pflanzlichen Organismen - kumulative Dissertation

Abstract

CYP74-Enzyme stellen wichtige Verzweigungspunkte im so genannten Lipoxygenase (LOX)-Stoffwechselweg dar, der zur Bildung von Oxylipinen führt. Einige dieser Substanzen wirken als Signalstoffe in der pflanzlichen Enzwicklung und bei der Antwort auf biotischen und abiotischen Stress. Zu den CYP74-Enzymen zählen die Allenoxidsynthase (AOS), Hydroperoxidlyase (HPL) und die Divinylethersynthase( DES). Innerhalb dieser Arbeit wurden neue CYP74-Enzyme isoliert, charakterisiert und ihre mögliche Funktion untersucht. Im Mittelpunkt standen dabei Enzyme mit bisher nur wenig charakterisierten Eigenschaften. So fand sich in Kartoffel eine AOS mit einer hohen Substratpräferenz gegenüber 9-Hydroperoxiden der Linolsäure. Dieses Enzym findet sich vor allem in unterirdischen Organen. Immunzytologische Analysen zeigten eine Lokalisierung an Amyloplasten in Wurzeln und Knollen. Mit einer neu entwickelten Methode gelang erstmals die Quantifizierung der durch dieses Enzym gebildeten Metabolite in pflanzlichen Geweben. Aus dem Moos Physcomitrella patens gelang erstmals die Isolierung einer cDNA, welche für eine HPL kodiert. Dieses Enzym zeigt eine breites Substratspektrum und metabolisiert Hydroperoxide verschiedener Fettsäuren. Ein weiteres Untersuchungsobjekt stellte die Bildung von Etherolsäure, einem Divinylether, in Knoblauch dar. Neben der Isolierung des entsprechenden Enzyms, wurden sowohl sein Transkript als auch seine Reaktionsprodukte in Wurzeln und Knollen nachgewiesen. Zur Untersuchung der Funktion von CYP74-Enzymen wurden Deletionsmutanten einer HPL und einer AOS in Arabidopsis analysiert. Nach Verwundung steigt der Gehalt an verschiedenen Oxylipinen. Ebenso findet sich eine Induktion verschiedener Abwehrgene. Während hpl-Pflanzen keinen Unterschied zu Wildtyppflanzen zeigten, fand sich in aos-Pflanzen ein Rückstau an 13-Hydroperoxiden, der auch zu einer Erhöhung der Gehalte an den entsprechenden Hydroxy- und Ketofettsäuren führte. In diesen Pflanzen zeigten sich auch Unterschiede in den Transkriptmengen von jasmonatinduzierten Genen wie vsp, hpl und lox2.

Oxylipins is a collective term for oxygenated metabolites derived from polyunsaturated fatty acids. They are bioactive compounds involved in signal and defence reactions in mammals, higher plants and algae. The biosynthesis of many oxylipins in plants takes place in the lipoxygenase pathway involving reactions of CYP74-enzymes. Up to now three different enzyme families are known belonging to CYP74: allene oxide synthase (AOS), hydroperoixde lyase (HPL) and divinyl ether synthase (DES). Subject of this work was the identification and characterisation of new CYP74s and the analysis of their functions. An AOS having a high substrate preference to 9-hydroperoxides of linoleic acid was isolated from potato. This enzyme is mainly found in subterraneous organs. Immunocytological analysis shows a subcellulare localisation at amyloplasts of roots and tubers. Using a newly established method metabolites formed by this enzymes could be quantified in subterraneous plant organs. In the moss Physcomitrella patens a HPL was isolated having a broad substrate spectrum. The enzyme use different hydroperoxides of linoleic, linolenic and arachidonic acid as substrate. Another subject was the analysis of the formation of etholenic acid (a divinyl ether) in garlic (Allium sativum). Beside the isolation of the responsible enzyme the transcript and the reaction products were detected in roots and bulbs. To investigate the function of CYP74 in Arabidopsis deletion mutants of hpl- and aos-gene were analysed. After mechanical wounding of Arabidopsis leaves the amount of different oxylipins increases. An induction of different defence genes is also observed. While hpl-plants show no difference to wildtyp, in aos-plants an accumulation of 13-hydroperoxides is observed. This accumulation leads to an increase in the corresponding hydroxy and keto fatty acids. These plants show also differences in the transcript level of jasmonate inducible genes like vsp, hpl and lox2.