In vitro protein engineering approaches for the development of biochemical, diagnostic and therapeutic tools

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Hochdurchsatz Protein Produktion zur Generierung, in vitro Expression, Reinigung und Interaktionsanalyse rekombinanter Proteine entwickelt. Für die gerichtete Präsentation sequenzspezifisch biotinylierter Fusionsproteine auf Streptavidin-beschichteten SPR-Sensoren wurde die Methode der zellfreien, enzymatischen in situ Monobiotinylierung entwickelt. Zur Erhöhung des Durchsatzes wurde auf Basis der gekoppelten in vitro Transkription und Translation ein Ribosome Display Protokoll etabliert, um bindeaktive Proteine vorzuselektieren. Bei der Etablierung des Ribosome Display Protokolls konnte gezeigt werden, dass translationsarretierende, naszierende Aminosäuresequenzen, wie das SecM Peptid, die tmRNA-vermittelte Proteindegradierung induzieren und dadurch die Effizienz einer Ribosome Display Selektion negativ beeinflussen können. Das System wurde dazu verwendet, die IGF-1 Bindungskinetiken von 32 verschiedenen, sequenzspezifisch mutierten IGF-Bindedomänen des humanen IGFBP-4 (mini-BP4) zu analysieren. Weterhin wurden aus einer sequenzspezifisch randomisierten mini-BP4 Bibliothek IGF-1 bindungsaktive Konstrukte selektiert und die IGF-1 Bindungsrelevanz einzelner Aminosäurepositionen innerhalb der mini-BP4 Sequenz charakterisiert. Das System wurde zur Selektion und Produktion von de novo Bindeproteinen verwendet. Dabei wurden ungerichtet mutagenisierte Varianten des humanen Gerüstproteins γ Kristallin mit moderater Bindeaktivität gegenüber den Ectodomänen der Rezeptortyrosinkinasen erbB2 und erbB3 selektiert. Der evolutive Ansatz bestätigte das sequentielle Faltungsverhalten der γ Kristallin-Domänen. Weiterhin wurde die hemopexin-ähnliche Proteindomäne der humanen MMP-2 (MMP-PEX2) als Proteingerüst für die Entwicklung neuartiger Bindeproteine erstmals diskutiert und validiert.

A High Throughput Protein Production (HTPP) platform is described, which enables the automated generation, expression and purification of recombinant proteins in a small-scale. A cell-free system was used to perform a sequence specific, enzymatic in situ monobiotinylation of biotin-accepting-peptide fused proteins. These proteins were immobilized in an oriented manner on streptavidin-coated biosensor surfaces to determine kinetic data of protein-protein interactions using the SPR technology. In this way, 32 site-directed mutated IGFBP-4 IGF-binding domains were synthesized, assembled into Linear Expression Elements (LEEs), transcribed and translated in vitro, purified and refolded in order to elucidate the structure-functional implication of specific amino acid substitutions on the mini-BP4/IGF-I interaction. To expand the throughput of HTPP a Ribosome Display protocol was established. The influence of translation-regulating, nascent peptides like the SecM sequence were elucidated with regard to the yield and performance of the display. Ribosome display was used to screen a sequence-specific randomized mini-BP4 library for IGF-I binding-active mutants. The results revealed further information about the IGF-I binding-relevance of distinct amino acids in the mini-BP4-sequence. Finally, ribosome display was used for the selection of scaffold proteins with de novo binding properties. Human γ crystallin derivatives were tested to perform in ribosome display versus the human erbB2 and erbB3 receptor ectodomains. The proposed sequential folding and paused translation mechanism of γ crystallin was confirmed by these results. Heading towards new protein scaffold strategies a completely new approach was made to engineer the hemopexin-like protein domain as a general source for binding proteins. We could show that the MMP-PEX2 hemopexin-like protein-domain performs in a ribosome display selection procedure and is also amenable to be used in diverse library strategies. On the basis of these data, future approaches will lead to the establishment of an automated platform technology for the cell-free production of tailored multi-purpose binding proteins.