Die Struktur und Funktion des CDF-Proteins CzcD aus Cupriavidus metallidurans

Abstract

Cupriavidus metallidurans CH34 ist ein Gram-negatives β-Proteobakterium, dass sich durch eine Vielzahl unterschiedlicher Efflux-Systeme auszeichnet. Die czc-Resistenz-Determinante, die auf dem Megaplasmid pMOL30 lokalisiert ist, vermittelt Resistenz gegenüber den Schwermetallen Cobalt, Zink und Cadmium. Die Hauptentgiftungskomponente ist dabei der RND-Efflux-Komplex CzcCBA, ein Protonen/Kationen-Antiporter. Dieser ist in der Lage Schwermetallionen vom Peri- bzw. Zytoplasma zur Außenseite der Zelle zu transportieren. Das Membranprotein CzcD wurde als erster Vertreter der CDF-Proteinfamilie beschrieben. Das Protein ist in der Lage die Zelle vor Schwermetall-Kationen zu schützen. CzcD vermittelt erhöhte Zn(II)-Resistenz im sensitiven E. coli-Stamm GG48 und Co(II)-Resistenz im cobaltsensitiven E. coli-Stamm ECA349. In energetisierten Membranvesikeln mit NADH konnte der direkte Transport von Zink, Cobalt und Cadmium durch CzcD gezeigt werden. Dabei konnte der Affinitätsparameter Km für Zink von 2.2 µM ermittelt werden. Der Transport der Schwermetalle durch CzcD war abhängig von einem Protonengradienten. In Proteoliposomen konnte neben Zn(II) zusätzlich ein Transport von Fe(II) durch CzcD nachgewiesen werden. Mittels gezielter Aminosäureaustauschmutationen konnte die Funktion wichtiger konservierter Aminosäuren auf die Transportaktivität von CzcD untersucht werden. Dabei sind Histidin-, Glutamat- und Aspartat-Reste für die Bindung und dem Transport der Schwermetalle verantwortlich. Mittels Röntgenkleinwinkelstreuungsexperimente konnten erste Modelle vom Gesamtprotein CzcD und der zytoplasmatischen Domäne von CzcD erhalten werden.

Cupriavidus metallidurans CH34 is a gram-negativ bacterium, which belongs to the β-Proteobacteria. The bacterium possesses various metal efflux systems. The czc-resistance-determinant, which is localized on the megaplasmid pMOL30, mediates resistance against cobalt, zinc and cadmium. The main component for detoxification is the RND-efflux-complex CzcCBA. These proteins function as a proton/cation antiporter and are able to transport cations from the periplasm or cytoplasm to the outside of the cell. The membrane protein CzcD is the first described representative of the CDF-protein family. CzcD is able to protect the cell against heavy metal cations. It also mediates increased Zn(II)-resistance in the sensitive E. coli strain GG48 and Co(II)-resistance in the Co(II)-sensitive strain E. coli ECA349. In inside out vesicles energized by NADH energy-dependent transport of zinc, cobalt and cadmium by CzcD was shown. The substrate affinity parameter Km for zinc was defined as 2.2 µM. Furthermore, the transport of heavy metal cations was dependent on a proton gradient. In proteoliposoms the transport of Zn(II) and additionally of Fe(II) by CzcD was shown. Using side directed mutagenesis the function of important and conserved amino acid residues in the transport activity of CzcD were investigated. Histidine-, Glutamate- and Aspartate-residues were involved in the binding and transport of heavy metal cations. Small angle x-ray scattering experiments revealed a first model of the complete protein CzcD and its cytoplasmic C-terminal domain.