Role of USP48 and A20 on cell survival of gastric epithelium during Helicobacter pylori infection

Abstract

Helicobacter pylori is a human pathogen colonising the epithelium of gastric mucosa and is etiologically related to gastric diseases and cancer. H. pylori, via its effector ADP-L-glycero-β-D-manno-heptose (ADP-heptose), induces nuclear factor kappalight- chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) signalling, which contributes to inflammation and resistance to apoptotic cell death. H. pylori-induced NF-κB can support the long-term colonisation of the bacteria, increasing the risks of disease development. Therefore, understanding the regulation of H. pylori-induced NF-κB, might pave the road for novel therapeutic approaches to gastric diseases including cancer. NF-κB signal transmission can be regulated by protein modifications, including ubiquitinylation. Deubiquitinylases (DUBs) counteract ubiquitin modification, thereby contributing to NF-κB control. Herein, the nuclear DUB ubiquitin-specific peptidase 48 (USP48) stabilises the nuclear pool of NF-κB/RelA and facilitates sustained NF-κB activity. Mechanistically, the cullin-RING ubiquitin ligase (CRL) complex elongin-cullinsuppressor of cytokine signalling 1 (ECSSOCS1) facilitates K48-ubiquitinylation and proteasomal degradation of NF-κB/RelA in the nucleus, leading to the termination of nuclear RelA activity. I demonstrated that USP48 stabilises RelA by deubiquitinylation, thereby promoting the transcriptional activity of RelA to prolong de novo synthesis of the DUB A20 in H. pylori infection. Furthermore, USP48 enhances A20 expression, which suppresses caspase 8 activity and apoptotic cell death in H. pylori-infected gastric epithelial cells. Additionally, ubiquitin ligation of RelA by the CRL2 is inhibited by the multiprotein complex COP9 signalosome (CSN) that inactivates CRLs by deneddylation. Here, I have identified a mechanism by which CSN-associated USP48 and A20 synergistically regulate RelA and apoptotic cell death in H. pylori infection. In the gastric mucosa, the epithelium is closely in contact with the surrounding stromal cells, involving fibroblasts which control proliferation, differentiation, and apoptosis of epithelial cells. Therefore, the analysis of the molecular crosstalk between gastric fibroblasts and epithelial cells is highly relevant for understanding the development of gastric diseases during H. pylori infection. In this thesis, I addressed the influence of fibroblasts on the apoptosis of gastric epithelial cells. Here, I showed the protective role of human gastric fibroblasts on H. pylori-induced apoptotic cell death of polarised gastric carcinoma cells and primary gastric mucosoids. Mechanistically, I identified that the fibroblast-dependent protection against apoptotic cell death in H. pylori-infected epithelial cells is in part supported by the upregulation of A20 expression. The rise of microfluidic cell-on-a-chip technology provides an opportunity to recapitulate and miniaturise the in vivo situation for biomedical studies. The microfluidic chip established in this thesis contains two microfluidic channels separated by a porous membrane lined by polarised gastric epithelial (NCI-N87) cells. A dynamic environment was emulated with media flowing at a constantly low rate (0.5 μl/min). Interestingly, results showed that the barrier integrity of gastric epithelial monolayer is enhanced with continuous media flow, compared to the static conditions. Furthermore, I experimentally analysed drug-induced apoptotic cell death in gastric epithelial cells by integrating the cell-on-a-chip with the Incucyte® live-cell imaging system. In addition to this work, to better mimic in vivo situations, this microfluidic system could be used for H. pylori-induced apoptotic cell death in primary gastric mucosoids. This could be a valuable tool for studying the molecular crosstalk between cells of the microenvironment in response to infections. Collectively, the thesis addressed the molecular interplay of USP48 and A20 in regulating NF-κB transcriptional activity and apoptotic cell death in the H. pyloriinfected gastric epithelium. Moreover, considerable insights were obtained into the impact of cells from the micromilieu on H. pylori-induced A20 expression and apoptotic cell death. By using cell-on-a-chip technologies these investigations provide opportunities to develop therapeutic strategies.

Helicobacter pylori ist ein menschlicher Krankheitserreger, der das Epithel der Magenschleimhaut besiedelt und ätiologisch mit Magenerkrankungen und Krebs in Verbindung gebracht wird. H. pylori induziert über seinen Effektor ADP-L-Glycero-β-Dmanno- Heptose (ADP-Heptose) die Signalübertragung durch den Nuklearfaktor Kappa-Lichtketten-Enhancer aktivierter B-Zellen (NF-κB), der zur Entzündung und zur Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod beiträgt. Der durch H. pylori induzierte NFB- Signalweg kann die langfristige Besiedlung durch das Bakterium begünstigen und das Risiko der Krankheitsentwicklung erhöhen. Daher könnte das Verständnis der Regulierung von H. pylori-induziertem NF-κB den Weg zu neuen therapeutischen Ansätzen für Magenkrankheiten einschließlich Krebs ebnen. Die NF-κB-Signalübertragung kann durch Proteinmodifikationen, einschließlich Ubiquitinylierung, reguliert werden. Deubiquitinylasen (DUBs) wirken der Ubiquitinmodifikation entgegen und tragen so zur NF-κB-Kontrolle bei. Die nukleäre DUB Ubiquitin-spezifische Peptidase 48 (USP48) stabilisiert den nukleären Pool von NF-κB/RelA und ermöglicht eine anhaltende NF-κB-Aktivität. Mechanistisch gesehen erleichtert der Cullin-RING-Ubiquitin-Ligase (CRL)-Komplex Elongin-Cullin-Suppressor of Cytokine Signalling 1 (ECSSOCS1) die K48-Ubiquitinylierung und den proteasomalen Abbau von NF-κB/RelA im Zellkern, was zur Beendigung der nukleären RelA-Aktivität führt. Ich habe gezeigt, dass USP48 RelA durch Deubiquitinylierung stabilisiert und dadurch die Transkriptionsaktivität von RelA fördert, um die De-novo-Synthese des DUB A20 bei einer H. pylori-Infektion zu verlängern. Darüber hinaus steigert USP48 die Expression von A20, was die Aktivität von Caspase 8 und den apoptotischen Zelltod in H. pylori infizierten Magenepithelzellen unterdrückt. Darüber hinaus wird die Ubiquitin-Ligation von RelA durch CRL2 durch den Multiproteinkomplex COP9- Signalosom (CSN) gehemmt, der CRLs durch Deneddylierung inaktiviert. Hier habe ich einen Mechanismus identifiziert, durch den CSN-assoziiertes USP48 und A20 RelA und den apoptotischen Zelltod bei einer H. pylori-Infektion synergistisch regulieren. In der Magenschleimhaut steht das Epithel in engem Kontakt mit den umgebenden Stromazellen, an denen Fibroblasten beteiligt sind, die die Proliferation, Differenzierung und Apoptose der Epithelzellen kontrollieren. Daher ist die Analyse des molekularen Crosstalks zwischen Magenfibroblasten und Epithelzellen von großer Bedeutung für das Verständnis der Entwicklung von Magenerkrankungen während einer H. pylori-Infektion. In dieser Arbeit habe ich den Einfluss von Fibroblasten auf die Apoptose von Magenepithelzellen untersucht. Dabei konnte ich die schützende Rolle menschlicher Magenfibroblasten auf den H. pylori-induzierten apoptotischen Zelltod von polarisierten Magenkarzinomzellen und primären Magenschleimhäuten nachweisen. Mechanistisch gesehen habe ich festgestellt, dass der von Fibroblasten abhängige Schutz vor dem apoptotischen Zelltod in H. pylori infizierten Epithelzellen zum Teil durch die Hochregulierung der A20-Expression unterstützt wird. Das Aufkommen der mikrofluidischen Cell-on-a-Chip-Technologie bietet die Möglichkeit, die in vivo-Situation für biomedizinische Studien zu rekapitulieren und zu miniaturisieren. Der in dieser Arbeit entwickelte mikrofluidische Chip enthält zwei mikrofluidische Kanäle, die durch eine poröse Membran getrennt sind, die mit polarisierten Magenepithelzellen (NCI-N87) ausgekleidet ist. Es wurde eine dynamische Umgebung emuliert, in der die Medien mit einer konstant niedrigen Rate (0,5 μl/min) fließen. Interessanterweise zeigten die Ergebnisse, dass die Integrität der Barriere der Monoschicht des Magenepithels bei kontinuierlichem Medienfluss im Vergleich zu den statischen Bedingungen verbessert wird. Außerdem analysierte ich experimentell den medikamenteninduzierten apoptotischen Zelltod in Magenepithelzellen, indem ich den Cell-on-a-Chip mit dem Incucyte-Live-Cell-Imaging- System kombinierte. Zusätzlich zu dieser Arbeit könnte dieses mikrofluidische System zur besseren Nachahmung von In-vivo-Situationen für den von H. pylori ausgelösten apoptotischen Zelltod in primären Magenschleimhäuten verwendet werden. Dies könnte ein wertvolles Instrument zur Untersuchung des molekularen Zusammenspiels zwischen Zellen der Mikroumgebung als Reaktion auf Infektionen sein. Insgesamt wurde in dieser Arbeit das molekulare Zusammenspiel von USP48 und A20 bei der Regulierung der NF-κB-Transkriptionsaktivität und des apoptotischen Zelltods im H. pylori-infizierten Magenepithel untersucht. Darüber hinaus konnten wesentliche Erkenntnisse über den Einfluss von Zellen aus dem Mikromilieu auf die H. pyloriinduzierte A20-Expression und den apoptotischen Zelltod gewonnen werden. Durch den Einsatz von Zell-on-a-Chip-Technologien bieten diese Untersuchungen die Möglichkeit, therapeutische Strategien zu entwickeln.