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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3797
Title: Untersuchungen zum Verständnis von Substrat-Liganden-Affinität mit Hilfe von Proteinase Engineering
Author(s): Tziridis, Anastasia
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2008
Extent: Online-Ressource, Text + Image (kB)
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000013916
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Online-Publikation
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Im Rahmen der Dissertation wurden ausgehend von einem Faktor Xa-Trypsin-Modellsystem Varianten der Serinproteinase Trypsin gezielt modifiziert, ihre Struktur röntgenkristallografisch aufgeklärt und ihre Spezifität untersucht, insbesondere die strukturelle Ähnlichkeit untereinander und die Selektivität unterschiedlicher Substrate bzw. Inhibitoren. Bei diesem Modellsystem war durch ortsgerichtete Mutagenese des Rindertrypsins die spezifitätsbestimmenden Merkmale der Substratbindetasche des Gerinnungsfaktors Xa übertragen worden. Dabei hatte sich eine Flexibilität im Bereich der Substratbindetasche gezeigt, die sich sowohl auf die Struktur des Enzyms als auch auf die Enzymhemmung bedeutend ausgwirkt. In zwei Ansätzen wurden zusätzliche Mutationen eingeführt, um die aufgetretene Flexibilität zu steuern. Im ersten Ansatz konnte durch eine Ser-Cys-Mutation erfolgreich ein molekularer Schalter in die Proteinase eingeführt werden. Dadurch lies sich bei der aktiven Proteinase durch kovalente in vitro-Umsetzung der Thiol-Gruppe mit der organischen Quecksilberverbindung p-Chloromercuribenzoat ein sperrigerer Rest der Seitenkette erzeugen, der den flexiblen Bereich der Bindetasche stabilisieren konnte, was schließlich in der Kristallstruktur sichtbar wurde. Der zweite Ansatz verfolgte die Kontrolle der Flexibilität durch eine innere sterische Hinderung. In einem Bereich im Inneren der Proteinase, der an die Bindetasche mit der aufgetretenen Flexibilität angrenzt, wurden weitere Mutationen in den Positionen 227 (Val 227Ile/Phe) und 217 (Ser217Glu) hinzugefügt. Die neuen Mutationen alleine führten zunächst zu keiner strukturellen Veränderung, sondern vielmehr zu einer Verschlechterung der Hemmkonstanten der getesteten Inhibitoren. Das Zusammenspiel mehrerer Mutationen erzeugte jedoch eine Variante, die keine Flexibilität mehr aufwies und sowohl strukturell als auch bei den Hemmkonstanten dem Faktor Xa gleichwertig war. In einem dritten Ansatz wurde die Spezifität der Bindetasche des Rindertrypsins derart verändert, dass es als Surrogat für Enterokinase zur Spaltung von Fusionsproteinen dienen kann. Es wurde eine neue, enterokinaseähnliche Trypsin-Variante hergestellt, charakterisiert und an vier verschiedenen Fusionsproteinen getestet. Dabei zeigte sich, dass dieses die untersuchten Fusionsproteine sogar schneller spalten kann als im Vergleich die kommerzielle Enterokinase. Die in der Arbeit untersuchten Beispiele der veränderten Proteinase Trypsin zeigen, dass sich Spezifitäten von Proteinasen relativ leicht abwandeln lassen, sich aber die resultierenden Proteinmutationen höchst komplex auswirken können.
Within the scope of the thesis several variants of the serine proteinase trypsin were specifically modified, xray-structures resolved and their specificities determined especially their structural similarity and the specificities to various substrates and inhibitors. Starting point of the thesis was a factor Xa-trypsin-model system, where the specificity determining properties of the binding site of factor Xa were introduced into trypsin. This revealed a flexibility of the binding site with substantial effects on structure and enzyme inhibition. Two approaches were followed to control the flexibility. The first method was to introduce a molecular switch by a Ser-Cys-mutation followed by a covalently in vitro-modification with the organic Hg-compound p-chloromercurybenzoate. This generated a bulky residue stabilizing the flexible area proven in the crystal structure. In the second approach mutations of residue 227 (Val 227Ile/Phe) and 217 (Ser217Glu) neighbouring to the flexible area were realized to cause steric hindrance. The new mutations alone could not cause any structural change, rather a worsening of enzyme inhibition. But the interplay of several mutations generated a trypsin variant that showed no flexibility but structure and enzyme inhibition data equivalent to factor Xa. The third task was to modify the specificity of trypsin to create a surrogate for enterokinase, which is often used for fusion protein cleavage. Based on bovine trypsin an enterokinase-like trypsin with mutations in the binding site was produced, characterized and tested with four different fusion proteins. The tests showed good and even more activity against the fusion proteins compared to commercial enterokinase. The examined trypsin variants show, that specificities of proteinases can be changed very easily. However the resulting consequences can be complex and involved in many effects.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/10582
http://dx.doi.org/10.25673/3797
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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