Monogenic causes of severe fetal abnormalities leading to prenatal or perinatal lethality : lessons from Neu-Laxova syndrome

Abstract

Serine biosynthesis disorders (SBD) are a group of neurological and multisystem disorders caused by a defect in one of the three synthesizing enzymes of the L-serine biosynthesis pathway. They comprise a spectrum of very rare autosomal recessive inborn errors of metabolism with wide phenotypic variability. Neu-Laxova syndrome (NLS) represents the most severe expression, and it is characterized by multiple congenital anomalies and pre- or perinatal lethality. L-serine is a non-essential amino acid and plays manifold roles in metabolism, cell proliferation, growth, and differentiation due to its importance in the one-carbon unit metabolism and the availability of methyl groups. L-serine is also particularly important for development and function of the central nervous system (CNS), since it is the precursor of two neuroactive signaling molecules: glycine and D-serine. This study aimed to extend the mutation spectrum causing SBD, including the identification of novel mutations in already known genes as well as possible novel genes, and at a detailed phenotypic analysis in 15 unrelated families with severe types of SBD to delineate genotype-phenotypes correlations. This study revealed likely disease-causing variants in the PHGDH and PSAT1 genes, several of which have not been reported previously. Phenotype analysis and a comprehensive review of the literature corroborated the evidence that SBD represent a continuum with varying degrees of phenotypic severity. It has been assumed that the variability in the phenotype results from the degree of the residual enzyme activity. To check the validity of this assumption, and because PHGDH is the first enzyme in serine biosynthesis pathway, this study focused on functional studies of PHGDH. Modeling of PHGDH defects of both, NLS and non-lethal serine biosynthesis disorders (SBDNL), was done using genome editing tools. Knock-out PHGDH HEK293 cells (koHEK) were established using CRISPR/Cas9 and these cells were later used to transiently express different mutants of PHGDH in vitro. Also, via gene targeting of the endogenous safe harbor locus AAVS1 of these koHEK cells, several stable models of mutant PHGDH were established using TALEN system as another genome editing tool. The transient and stable mutant PHGDH cell lines were then used to quantify the residual activity of mutant PHGDH enzymes and demonstrate their effect on the proliferation of the cells. This approach proved useful to confirm the functional incapacity of various SBD-associated mutants and pointed at different modes of inactivation. The employed model systems could also partially demonstrate different levels of residual PHGDH activity correlating with disease severity.

Serin-Biosynthese-Defekte (SBD) sind eine Gruppe von Multisystem-Erkrankungen mit prädominierenden neurologischen Störungen, welche durch einen Defekt in einem der drei Enzyme des L-Serin-Biosyntheseweges verursacht werden. Sie umfassen ein Spektrum sehr seltener autosomal-rezessiver angeborener Stoffwechselstörungen mit großer phänotypischer Variabilität. Das Neu-Laxova-Syndrom (NLS) stellt die schwerste Form dar und ist durch multiple angeborene Anomalien und prä- oder perinatale Letalität gekennzeichnet. L-Serin ist eine nicht essentielle Aminosäure und spielt durch seine Bedeutung im Stoffwechsel von C1-Einheiten und für die Verfügbarkeit von Methylgruppen eine vielfältige Rolle im Stoffwechsel, der Zellproliferation, dem Wachstum und der Differenzierung. Daneben ist L-Serin auch wichtig für die Entwicklung und Funktion des zentralen Nervensystems, da es die Vorstufe zweier neuroaktiver Signalmoleküle ist: Glycin und D-Serin. Diese Doktorarbeit zielte darauf ab, das Mutationsspektrum bei SBD zu erweitern, einschließlich der Identifizierung neuer Mutationen in bereits bekannten Genen sowie möglicher neuer Gene, und vollzog eine detaillierte phänotypische Analyse in 15 nicht verwandten Familien mit schweren Formen von SBD, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen aufzuzeigen. Es wurden wahrscheinlich krankheitsverursachende Varianten in den Genen PHGDH und PSAT1 identifiziert, von denen einige zuvor noch nicht bekannt waren. Die Phänotyp-Analyse und eine umfassende Überprüfung der Literatur bestätigen, dass SBD ein Kontinuum mit unterschiedlichem Grad an phänotypische Ausprägung darstellt. Es wird angenommen, dass die Variabilität des Phänotyps aus dem Grad der verbleibenden Enzymaktivität resultiert. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen und da PHGDH das erste Enzym im Serin-Biosyntheseweg ist, konzentrierte sich diese Doktorarbeit auf funktionelle Studien von PHGDH. Die Modellierung von PHGDH-Defekten sowohl bei NLS- als auch bei nicht letalen Formen des Serinbiosynthese-Defekts (SBDNL) erfolgte unter Verwendung von Genom-Editing-Tools. Unter Verwendung von CRISPR/Cas9 wurden Knock-out-PHGDH HEK293 (koHEK)-Zellen etabliert und diese Zellen wurden später verwendet, um transient unterschiedliche Mutanten von PHGDH in vitro zu exprimieren. Darüber hinaus wurden durch Gen-Targeting des endogenen Safe-Harbor-Locus AAVS1 dieser koHEK-Zellen mehrere stabile Expressions-Modelle der mutierten PHGDH unter Verwendung des TALEN-Systems als weiteres Genom-Editierungswerkzeug etabliert. Die transienten und stabilen mutanten PHGDH-Zelllinien wurden wiederum verwendet, um die Aktivität der verschiedenen PHGDH Mutationen zu quantifizieren und ihren Einfluss auf die Zellproliferation zu beschreiben. Dieser Ansatz erwies sich als geeignet, den funktionellen Defekt SBD-assoziierter PHGDH-Mutationen zu belegen und wies darauf hin, dass unterschiedliche Mechanismen der Inaktivierung vorliegen können. Die verwendeten Modellsysteme konnten teilweise unterschiedliche Grade von Enzymrestaktivität zeigen, die mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren.