Microvascular damage, neuroinflammation and extracellular matrix remodeling in Col18a1 knockout mice as a model for early cerebral small vessel disease

Abstract

The extracellular matrix (ECM), primarily composed of collagen, offers critical structural and mechanical foundations for all multicellular organisms. It plays an influential role in determining cellular activities, including cell growth, programmed cell death, morphology, movement, and differentiation. Specialized ECM structures known as basement membranes (BMs) coat most layers of epithelial and endothelial cells. Beyond their foundational and partitioning roles, BMs and their constituents participate in diverse biological signaling pathways, growth processes, and disease developments. Collagen XVIII is a well-conserved component within BMs throughout evolutionary history. This multi-domain heparan sulfate proteoglycan (HSPG) is manifested in three distinct tissue-specific forms. All three versions of collagen XVIII feature Endostatin, their C-terminal domain, known for its anti-angiogenic attributes. Earlier research on collagen IV, another primary BM element, highlighted pathological modifications in small arteries and capillaries in the absence of collagen IV in mice. These changes echo those seen in cerebral small vessel disease (CSVD), such as age-related blood-brain barrier (BBB) deffects and restructuring of the vessel wall, which can lead to vessel blockages and surrounding bleeds. CSVD stands as a primary contributor to vascular cognitive issues, playing a role in numerous neurological conditions, from strokes and mild cognitive deficits to dementia. A key objective of this thesis was to investigate if deletion of the collagen XVIII may results in development of CSVD-like pathology in terms of microvascular and neuroinflammatory alterations, and remodelling of perivascular, perineuronal and perisynaptic ECM. Based on our observations, Col18a1-/- mice at 5 months of age exhibited an increased BBB permeability to mouse IgG in deep gray matter regions. There were noticeable accumulations of intravascular erythrocytes in capillaries and arterioles located in the cortex, hippocampus, and deep gray matter, though less so in white matter. As Col18a1-/- mice aged, BBB permeability heightened in cortical areas and the hippocampus by 12 months, yet the increase in intravascular erythrocyte accumulations seemed to plateau or even reduce in certain regions. This contrasts with the rising accumulation trend in Col18a+/+ mice. Erythrocyte clustering seems to correspond with the noted upregulation of Vcam1, consistent with endostatin deficiency in Col18a1-/- mice. Subsequent qPCR analysis showcased significant alterations in the expression of BMs and components of tight junctions. Glial cells in Col18a1-/- mice indicated signs of activation, including decreased branching, larger cell bodies, closer vicinity to impaired vessels, and a surge in GFAP levels within astrocytes. An in-depth look into ECM remodeling revealed that 36% of parvalbumin-expressing (PV+) interneurons in the CA1 region of Col18a1-/- mice were devoid of Aggrecan+ (Acan+) perineuronal nets (PNNs). Moreover, the average intensity of Acan expression dwindled in PV+ Acan+ cells. Conversely, there was a pronounced accumulation of Brevican (Bcan) in the neuropil of Col18a1-/- mice, especially around perisynaptic sites. This accumulation correlated with a rise in protein levels that stabilize lectican-hyaluronic acid interactions (Hpln4), proteins that crosslink lecticans (Tnr), and a decrease in presynaptic VGLUT1. Another contributing factor to the buildup of perisynaptic ECM was the increased expression of TIMP-3 in Col18a1-/- mice, which has been observed in the CADASIL variant of CSVD. Delving into the underlying pathways of these observations, I identified heightened signaling via the TGF-ß1/SMAD3/TIMP-3 cascade. In essence, collagen XVIII is essential for maintaining the structural integrity of small vessels across the brain. Its absence results in small vessel impairment and pathological signs indicative of the early phases of CSVD, without evidence of hemorrhagic events or expansion of the perivascular area. This research also underscores a link between changes in perivascular ECM, extracellular proteolysis, and both perineuronal and perisynaptic ECM, suggesting these could be the foundational changes leading to synaptic and cognitive disturbances in CSVD.

Die kollagenbasierte extrazelluläre Matrix bietet allen vielzelligen Tieren strukturelle und mechanische Unterstützung. Sie hat entscheidende Auswirkungen auf das Zellverhalten, wie Proliferation, Apoptose, Form, Migration und Differenzierung. Basalmembranen (BM) sind hochspezialisierte EZM-Strukturen, die die meisten Epithel- und Endothelzellschichten auskleiden. Neben ihren unterstützenden und trennenden Funktionen sind die BM und ihre Bestandteile an einer Vielzahl von biologischen Signalkaskaden, Entwicklungsprozessen und dem Fortschreiten von Krankheiten beteiligt. Kollagen XVIII ist einer der BM-Bestandteile, die im Laufe der Evolution stark konserviert wurden. Es handelt sich um ein Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) mit mehreren Domänen, das in drei gewebespezifischen Varianten exprimiert wird. Endostatin, die C-terminale (carboxyterminale) globuläre Domäne aller drei Kollagen XVIIIVarianten, hat antiangiogene Eigenschaften. Frühere Studien zu Kollagen IV, einem weiteren Hauptbestandteil der BM, zeigten pathologische Veränderungen der kleinen Arterien und Kapillaren in Mäusen mit Kollagen-IV-Mangel. Diese ähnelten den Veränderungen bei der zerebralen Erkrankung der kleinen Gefäße (Cerebral Small Vessel Disease CSVD), wie z. B. dem altersabhängigen Abbau der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und dem Umbau der Gefäßwände, was sich in kleinen Gefäßverschlüssen und perivaskulären Blutungen manifestiert. CSVD ist eine der Hauptursachen für vaskuläre kognitive Beeinträchtigungen und trägt zu einem breiten Spektrum neurologischer Störungen bei, darunter Schlaganfall, leichte kognitive Beeinträchtigungen und Demenz. Ein Hauptziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob die Entfernung von Kollagen-XVIII zur Entwicklung einer CSVD-ähnlichen Pathologie in Bezug auf mikrovaskuläre und neuroinflammatorische Veränderungen und die Umgestaltung der perivaskulären, perineuronalen und perisynaptischen EZM führen kann. Unseren Ergebnissen zufolge wiesen 5 Monate alte Col18a1-Knockout (Col18a1-/-)-Mäuse eine erhöhte Durchlässigkeit der BHS für Maus-IgG in der tiefen grauen Substanz auf und es wurden intravaskuläre Erythrozytenansammlungen in Kapillaren und Arteriolen im Kortex, im Hippocampus und in der tiefen grauen Substanz beobachtet, wobei die Ansammlung in der weißen Substanz geringer war. Die Permeabilität der BHS nahm bei Col18a1-/--Mäusen mit dem Alter zu und betraf kortikale Regionen und den Hippocampus bei 12 Monate alten Mäusen, während die intravaskuläre Erythrozytenansammlung bei Col18a1-/--Mäusen mit dem Alter nicht weiter anstieg (und in einigen Unterregionen sogar abnahm), im Gegensatz zu dem bei Wildtyp-Mäusen beobachteten Anstieg. Die Veränderungen in der Erythrozytenanhäufung scheinen die beobachtete Hochregulierung von Vcam1 widerzuspiegeln, was mit dem Endostatinmangel bei Col18a1-/-- Mäusen in Einklang steht. Weitere qPCR-Analysen ergaben massive Veränderungen in der Expression von BM und Tight-Junctions-Komponenten. Die Gliazellen in Col18a1-/--Mäusen zeigten Merkmale einer Aktivierung, nämlich eine geringere Verzweigung, vergrößerte Somata, eine größere Nähe zu geschädigten Gefäßen und erhöhte GFAP-Werte in Astrozyten. Bei einer detaillierten Untersuchung des EZM-Umbaus stellten wir fest, dass 36 % der Parvalbuminexprimierenden (PV+) Interneuronen in der CA1-Region von Col18a1-/--Mäusen keine Aggrecan+(-Acan+)-perineuronalen Netze (PNNs) aufweisen. Darüber hinaus war die durchschnittliche Intensität der Acan-Expression in PV+-Acan+-Zellen reduziert. Andererseits fanden wir bei Col18a1-/--Mäusen eine erhöhte Akkumulation von Brevican (Bcan) im Neuropil im Allgemeinen und an perisynaptischen Stellen im Besonderen. Diese Hochregulierung war mit einer erhöhten Expression von Proteinen verbunden, die die Interaktion zwischen Lektikanen und Hyaluronsäure (Hpln4) stabilisieren, Lektikane vernetzen (Tnr) und präsynaptisches VGLUT1 herunterregulieren. Als zusätzlichen Faktor für die Anhäufung von perisynaptischer EZM fanden wir eine Hochregulierung von TIMP-3 in Col18a1-/--Mäusen, die bei der zerebralen autosomal dominanten Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukoenzephalopathie (CADASIL) gefunden wurde. Als Signalweg, der diesen Regulierungen zugrunde liegt, fand ich eine verstärkte Signalübertragung durch die TGF-ß1/SMAD3/TIMP-3-Kaskade. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich Kollagen XVIII als entscheidend für die strukturelle Integrität der kleinen Gefäße im gesamten Gehirn erwiesen hat. Sein Fehlen führt zu einer Schädigung der kleinen Gefäße und zu pathologischen Veränderungen, die typisch für frühe Stadien von CSVD sind, ohne dass es zu hämorrhagischen Veränderungen oder einer Erweiterung des perivaskulären Raums kommt. Darüber hinaus unterstreicht diese Studie einen Zusammenhang zwischen den Veränderungen der perivaskulären EZM, der extrazellulären Proteolyse und der perineuronalen/perisynaptischen EZM als möglichem Substrat für synaptische und kognitive Veränderungen bei CSVD.