E/I ratio is maintained constant in the cultured neocortical networks despite variation in the proportion of GABAergic interneurons

Abstract

The stable neocortical networks are generated by the number of glutamatergic projection neurons (PNs), and GABAergic interneurons (INs) maintained at a constant ratio. Since the PN/IN ratio deviations are often associated with the development of neuron pathologies, however, there are limited studies performed on how the altered PN/IN ratios may impact neuronal development and synaptic function. Therefore, during my Ph.D. study, I used cell culture techniques to generate neuronal networks with defined PN/IN ratios to address the question whether the manipulated PN/IN ratios vary over time and what impacts they may have on PNs and INs survival, proliferation, and the development of network activity, as well as how they influence the excitation/inhibition (E/I) balance of the individual cell. Networks with different PN/IN content were generated by plating PNs that were obtained from the dorsal cortex of wild-type animals at a density of 1500 cells/mm2. After 24 hours, 5% (low GABA, T05), 30% (medium GABA, T25), and 80% (high GABA, T45) of dissociated MGE precursor cells from VGAT-Venus transgenic rats were added, respectively. During the first week in vitro, the initial proportion of transplant INs in cultures was not altered, but the IN content modulated PN numbers, suggesting an increased proliferation in the presence of INs. In the following weeks (7-28 DIV), PNs and INs showed similar cell elimination dynamics. The fraction of INs increased or remained the same in the investigated cultures. The cellular PN/IN ratios remained constant, reflecting the initial plating. When the entire dorsolateral cortex (wCtx, a slightly more mature network containing more interneurons and post-mitotic projection neurons) was applied, the results differed. As there was a greater reduction in IN density in the wCtx networks, the proportion of INs decreased in all network types. Interestingly, the profile of rapid decline in IN fraction in the wCtx was not observed if the cultures were grown in gabazine (a GABAA receptor antagonist). Cultures developed spontaneous synchronous network activity at the end of the first week. This synchronous network activity can be examined by Fluo-3 fluorescence imaging of Ca2+ transients. A burst was defined as more than 10% of all active neurons activated simultaneously in a given field. The analysis of calcium imaging data showed an increase in burst frequency combined with a decrease in the number of neurons participating in a burst and desynchronization in the network with higher IN content (T45 networks). Network activity patterns varied between a stereotypically fully synchronized bursting activity and a more desynchronized bursting pattern with periodic excitability changes. To access the E/I balance of the individual cell, spontaneous glutamate-mediated currents (sEPSCs) and GABAA-mediated post-synaptic currents (sIPSCs) were recorded in 10-minute-long spontaneous voltage-clamp recordings in T05 and T45 networks in a total of 167 PNs and 229 INs between 6-30 DIV. Charge transfer of isolated sPSCs and sPSC burst charge transfer were calculated in each cell. With the help of Mini Analysis, we calculated the mean charge transfer of isolated sPSCs based on integral area values (pAms). An analysis of the mean charge transfer of sPSC bursts was conducted in MATLAB by computing the integral area values above the baseline. The results showed that no matter what the PN/IN proportions in the network, for both transplant types and both cell types, the sIPSC charge transfer/(sEPSC charge transfer + sIPSC charge transfer) ratio (cellar E/I balance) in isolated sPSC was mostly constant (except for a small change in INs of T05 networks). In contrast, when the sPSC bursts were considered, significant differences in the sIPSC burst charge transfer/(sEPSC burst charge transfer + sIPSC burst charge transfer) ratio (network bursts E/I balance) were detected between networks with different PN/IN proportions. In summary, the results of this study suggest that the cellular E/I balance may maintain constant, regardless of cell numbers. In contrast, the network bursts E/I balance and the maturation of spontaneous network activity are critically dependent on the structural PN/IN ratio.

Neokortikale Netzwerke weisen ein charakteristisches, konstantes Verhältnis zwischen der Anzahl der glutamatergen Projektionsneuronen (PN) und der GABAergen Interneuronen (IN) auf. Da Abweichungen in diesem Verhältnis häufig mit der Entwicklung von Neuronenpathologien in Verbindung gebracht werden, gibt es jedoch nur wenige Studien darüber, wie sich ein verändertes PN/IN-Verhältnis auf die neuronale Entwicklung und synaptische Funktion auswirken kann. In meiner Doktorarbeit habe ich Zellkulturtechniken verwendet, um neuronale Netzwerke mit definierten PN/IN-Verhältnissen zu erzeugen. In diesen definierten Netzwerken habe ich untersucht, ob sich die manipulierten PN/IN-Verhältnisse im Laufe der Zeit verändern und welche Auswirkungen die experimentell erzeugten PN/IN-Verhältnisse auf das Überleben und die zelluläre Proliferation von PNs und INs haben. Mit bildgebenden und elektrophysiologischen Methoden habe ich die Netzwerkaktivität, sowie das Erregungs-/Hemmungsgleichgewicht (E/I) einzelner Zelle in diesen Netzwerken analysiert. Netzwerke mit unterschiedlichem PN/IN-Gehalt wurden durch Ausplattieren von PNs, die aus dem dorsalen Kortex von Wildtyp-Tieren gewonnen wurden, in einer Dichte von 1500 Zellen/mm2 erzeugt. Nach 24 Stunden wurden 5% (niedriges GABA, T05), 30% (mittleres GABA, T25) bzw. 80% (hohes GABA, T45) der dissoziierten MGE-Vorläuferzellen von VGAT-Venus-transgenen Ratten hinzugefügt. Während der ersten Woche in vitro veränderte sich der ursprüngliche Anteil der Transplantat-INs in den Kulturen nicht, aber der IN-Gehalt modulierte die PN-Zahlen, was auf eine verstärkte Proliferation in Gegenwart von INs hindeutet. In den folgenden Wochen (7-28 DIV) zeigten PNs und INs eine ähnliche Dynamik der Zellelimination. Der Anteil der INs nahm in den untersuchten Kulturen zu oder blieb gleich. Die zellulären PN/IN-Verhältnisse blieben konstant, was die anfängliche Auspflanzung widerspiegelt. Wenn der gesamte dorsolaterale Kortex (wCtx, ein etwas reiferes Netzwerk mit mehr Interneuronen und post-mitotischen Projektionsneuronen) verwendet wurde, waren die Ergebnisse unterschiedlich. Da die IN-Dichte in den wCtx-Netzwerken stärker abnahm, sank der Anteil der INs in allen Netzwerktypen. Interessanterweise wurde das Profil des schnellen Rückgangs des IN-Anteils in den wCtx nicht beobachtet, wenn die Kulturen in Gabazin (einem GABAA-Rezeptor-Antagonisten) gezüchtet wurden. Die Kulturen entwickelten am Ende der ersten Woche spontane synchrone Netzwerkaktivität. Diese synchrone Netzwerkaktivität kann durch Fluo-3-Fluoreszenzbildgebung von Ca2+-Transienten untersucht werden. Als ein Burst wurde Netzwerkaktivität definiert, bei der mehr als 10% aller aktiven Neuronen innerhalb eines bestimmten Feldes gleichzeitig aktiv sind. Die Analyse der Kalzium-Bildgebungsdaten zeigte eine Zunahme der Burst-Häufigkeit in Verbindung mit einer Abnahme der Burst-Teilnahme und einer Desynchronisation in dem Netzwerk mit höherem IN-Gehalt (T45-Netzwerke). Die Aktivitätsmuster des Netzwerks variierten zwischen einer stereotyp voll synchronisierten Burst-Aktivität und einem eher desynchronisierten Burst-Muster mit periodischen Erregbarkeitsänderungen. Um das E/I-Gleichgewicht der einzelnen Zellen zu ermitteln, wurden spontane Glutamat-vermittelte Ströme (sEPSCs) und GABAA-vermittelte postsynaptische Ströme (sIPSCs) in 10-minütigen spontanen Spannungsklemmenaufzeichnungen in T05- und T45-Netzwerken in insgesamt 167 PNs und 229 INs zwischen 6-30 DIV aufgezeichnet. Der Ladungstransfer von isolierten sPSCs und der sPSC-Burst-Ladungstransfer wurden in jeder Zelle berechnet. Der mittlere Ladungstransfer von isolierten sPSCs wurde aus den integralen Flächenwerten (pAms) in MiniAnalysis ermittelt. Der mittlere Ladungstransfer von sPSC-Bursts wurde in MATLAB durch Berechnung der integralen Flächenwerte über der Basislinie analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass unabhängig von den PN/IN-Verhältnissen im Netzwerk für beide Transplantattypen und beide Zelltypen das Verhältnis von sIPSC-Ladungstransfer/(sEPSC-Ladungstransfer + sIPSC-Ladungstransfer) (zelluläres-E/I-Gleichgewicht) in isolierten sPSC weitgehend konstant war (mit Ausnahme einer kleinen Änderung in INs von T05-Netzwerken). Im Gegensatz dazu wurden bei Betrachtung der sPSC-Bursts signifikante Unterschiede im Verhältnis sIPSC-Burst-Ladungstransfer/(sEPSC-Burst-Ladungstransfer + sIPSC-Burst-Ladungstransfer) (Netzwerk-Bursts E/I- Gleichgewicht) zwischen Netzwerken mit unterschiedlichen PN/IN-Anteilen festgestellt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass das zelluläre E/I-Gleichgewicht unabhängig von der Anzahl der Zellen konstant bleibt. Im Gegensatz dazu sind das E/I-Gleichgewicht der Netzwerkbursts und die Reifung der spontanen Netzwerkaktivität kritisch vom strukturellen PN/IN-Verhältnis abhängig.