The Mcpt5-Cre mouse model for studying mast cells in the brain

Abstract

Mast cells (MCs) are sentinel and effector cells of the innate immune system and in that role, they are strategically positioned at almost all body-environmental interfaces. They are known for their diverse phenotypes depending on the local microenvironment. Due to their unique staining features, MCs were discovered very early in brain tissue as well, preferably residing at brain-periphery interfaces in the meninges, the choroid plexus (CP) and alongside parenchymal blood vessels. There, they are part of the blood-brain barrier (BBB) and bloodcerebrospinal fluid barriers (BCSFB) which allow them to spread effector molecules over the whole organ and beyond. Hence, they have a strong effect, even if rare in number, and were described to play important pro- or anti-inflammatory roles in the context of several neurological pathologies. The small cell number of brain MCs and the lack of an appropriate MC-specific mouse model may be reasons why little is known so far about sub-organ differences, molecular functions and their interactions with other cells in this specialized organ. Hence, this thesis aimed at elucidating the characteristics and functions of MCs in three different sub-organ localizations of the brain as part of a complex neuro-immune cell network. Therefore, the Mcpt5-Cre mouse model, popular for its high connective-tissue MC (CTMC)- specificity in peripheral tissues [1, 2], was used. Since it was never investigated for the brain, the usefulness and reliability of this mouse model was addressed as well in this context. To detect the rare cells in their native environment, an appropriate clearing and light sheet microscopy protocol for Mcpt5-Cre EYFP mouse brains was developed. Both, light sheet microscopy and transcriptome profiling revealed that, in the brain, the EYFP expression is not restricted to MCs. Further fluorescence microscopy methods identified mainly neurons to be targeted in the brain parenchyma, but also certain cell types of the CP and meninges. Astra blue safranin O (AB/SO) staining, a classical sequential MC detection method supported the above findings on histological slices and meningeal whole mounts. Surprisingly, it emerged that AB/SO allows not only to distinguish MC subtypes as it is usually used for, but also for detecting MC activation. This was finally evidenced by single cell transcriptome profiling of meningeal MCs and an activation assay designed for this specific purpose. Collectively, this thesis confirms the existence of MCs in cerebral tissues and presents a transcriptome profile for dura mater MCs which indicates connective-tissue like characteristics. Additionally, it displays limitations of the Mcpt5-Cre mouse line as a CTMC-specific model system and finally shows that the classical sequential MC staining method AB/SO identifies MC activation.

Mastzellen (MZ) sind Wächter- und Effektorzellen des angeborenen Immunsystems und als solche sind sie strategisch sinnvoll an beinahe allen umweltexponierten Körperstellen angesiedelt. Sie sind bekannt für ihre verschiedenen, von der lokalen Mikroumgebung geprägten, Phänotypen. Aufgrund ihrer einzigartigen Färbeeigenschaften wurden Mastzellen auch schon früh im Gehirn entdeckt, wo sie bevorzugt an den Übergängen von Gehirn und Peripherie, also in den Hirnhäuten, den Plexi choroidei und an parenchymalen Blutgefäßen vorkommen. Dort sind sie Teil der Bluthirnschranke und der Barrieren zwischen Blut und Zerebralflüssigkeit, was es ihnen ermöglicht, Effektormoleküle innerhalb des Gehirns und darüber hinaus zu verteilen. Trotz ihrer geringeren Anzahl, haben sie daher einen großen Einfluss, welcher als pro- oder antiinflammatorisch im Zusammenhang mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen beschrieben wurde. Die geringe Anzahl an zerebralen MZ und das Fehlen eines geeigneten MZ-spezifischen Mausmodells mögen Gründe dafür sein, dass bisher nur wenig über intra-organelle Unterschiede, deren molekulare Funktionen oder ihre Interaktionen mit anderen Zellen des Gehirns bekannt ist. Daher hat diese Arbeit zum Ziel, Eigenschaften und Funktionen von MZ als Teil eines komplexen neuroimmunologischen Netzwerks an drei verschiedenen Gehirnregionen aufzuklären. Dafür wurde das Mcpt5-Cre-Mausmodell verwendet. Dieses ist dafür bekannt, in peripheren Organen sehr spezifisch Bindegewebsmastzellen zu adressieren, was bisher jedoch nicht fürs Gehirn gezeigt wurde. Daher wurde das Mausmodell zuallererst auf seine Nutzbarkeit und Verlässlichkeit in diesem sehr speziellen Organ untersucht. Um die wenigen Zellen in ihrer natürlichen Umgebung detektieren zu können, wurde ein geeignetes Protokoll zur Gewebeklärung und anschließende Lichtblattmikroskopie für Mcpt5-Cre EYFPMausgehirne entwickelt. Sowohl die Lichtblattmikroskopie, als auch Transkriptomanalysen haben gezeigt, dass die Expression des gelb fluoreszierenden Proteins (EYFP) in diesen Mäusen nicht nur auf MZ beschränkt ist. Weitere fluoreszenzmikroskopische Methoden identifizierten zusätzlich vor allem Neuronen, aber auch andere Zellen des Plexus choroideus und der Hirnhäute. Astrablau und Safranin O (AB/SO)-Färbungen, als klassische sequenzielle MZ-Färbungen, unterstützten dabei die obigen Ergebnisse an histologischen Schnitten und intakten Hirnhäuten. Überraschenderweise zeigte sich dabei, dass die AB/SO-Färbung nicht nur die Unterscheidung von MZ-Subtypen ermöglicht, wofür sie üblicherweise verwendet wird, sondern auch MZ-Aktivierung widerspiegeln kann. Letzteres konnte abschließend anhand von Einzelzellsequenzierungen meningealer MZ und einem eigens dafür entwickelten Aktivierungsassay belegt werden. Zusammengefasst bestätigt diese Arbeit die Existenz zerebraler Mastzellen und präsentiert ein Transkriptomprofil für meningeale Mastzellen, was denen anderer Bindegewebs-MZ ähnelt. Außerdem zeigt sie Limitationen der Mcpt5-Cre-Mauslinie als MZ-spezifisches Modellsystem auf und verdeutlicht schlussendlich, dass die klassische AB/SO MZ-Färbung auch MZ-Aktivierung anzeigen kann.