Investigation of Actin-MRTF-A protein complexes in fibroblasts

Abstract

Regulation of MRTF activation via dissociation from actin for the regulation of fibroblasts maturation is still not clear and awaits further study. Here I aimed to identify candidates which compete with MRTF-A for actin binding and to visualize events resulting in the dissociation of actin and the intrinsically disordered RPEL motifs of MRTF-A. To identify MRTF competitors, isobaric labelling and label-free mass spectrometry approaches were applied after co-immunoprecipitation experiments. To visualize the events that lead to MRTF dissociation from actin in the cytosol, I aimed to generate a new FRET sensor. The FRET sensor needed to be characterized and validated. For this, the previously demonstrated effects of the FBS and of various MRTF interfering compounds over time were utilized. In particular, the influence of Latrunculin B, Cytochalasin D, Y-27632 and the overexpression of WH2 motif were followed over time after adding FBS. Furthermore, the action of CCG-203971 was investigated.

Die Regulierung der MRTF-Aktivierung über die Dissoziation von Aktin für die Regulierung der Fibroblastenreifung ist noch unklar und muss weiter untersucht werden. Hier habe ich versucht, Kandidaten zu identifizieren, die mit MRTF-A um die Bindung an Aktin konkurrieren, und Ereignisse sichtbar zu machen, die zur Dissoziation von Aktin und den intrinsisch ungeordneten RPEL-Motiven von MRTF-A führen. Zur Identifizierung von MRTF-Konkurrenten wurden nach Co-Immunpräzipitations-Experimenten isobare Markierungsverfahren und markierungsfreie Massenspektrometrie angewandt. Um die Ereignisse, die zur Dissoziation von MRTF von Aktin im Zytosol führen, sichtbar zu machen, wollte ich einen neuen FRET-Sensor entwickeln. Der FRET-Sensor musste charakterisiert und validiert werden. Dazu wurden die zuvor nachgewiesenen Auswirkungen der FBS und verschiedener MRTF-Störsubstanzen im Zeitverlauf genutzt. Insbesondere wurde der Einfluss von Latrunculin B, Cytochalasin D, Y-27632 und der Überexpression des WH2-Motivs nach Zugabe von FBS über die Zeit verfolgt. Außerdem wurde die Wirkung von CCG-203971 untersucht.