Microfluidic tools for bottom-up synthetic biology

Abstract

Bottom-up synthetic biology aims to rebuild biological cells from scratch. This the- sis shows how microfluidic technology can be used to produce, observe and manipulate model membranes with a focus on bottom-up synthetic biology applications. One of the features of life is compartmentalization. Creating cell-like compartments and encapsulating complex solutions is a fundamental task for bottom-up synthetic biol- ogy. Commonly used model compartments are lipid vesicles especially giant unilamellar vesicles (GUV). Although there are a lot of established methods to produce GUVs, new methods have to be developed to improve the modular cell building process, mainly the possibility to efficiently encapsulate a broad range of biological parts and modules. In this regard, the second chapter of the thesis shows how microfluidic devices can be used to generate monodisperse compartments with a higher encapsulation efficiency than current standard methods such as electroformation. After the production of dou- ble emulsions, various approaches for removal of residual oil are explored to create a phospholipid bilayer membrane. Next the integration of other complex modules such as energy supply and metabolic reactions with the compartment modules is tested. First an energy module is cre- ated from inverted membrane vesicles (IMV). The module is characterized via batch experiments and later encapsulated into water-in-oil droplets inside a microfluidic sys- tem. The second combination experiment employs the microfluidic vesicle production method presented before by encapsulating a complex metabolic pathway, the CETCH cycle, inside double emulsions. Another challenge where microfluidic tools are useful is the observation of processes inside of compartments or across their membrane. New methods are needed as the batch measurements, common in molecular biology, are often not suitable. One example is the vanishingly low volume of the solution inside the vesicle compared to the volume of the outer solution. As a result changes in fluorescence inside the vesicles are diminishable and in addition measurements on a single vesicle level are very difficult to perform or not possible depending on the experimental setup. A microfluidic design for physical immobilization of GUVs and the exchange of the outer solution is presented here. The possibilities and limitations of this device are explored with a membrane transport as- say. The influence of lipid composition and detergents on the membrane permeability are measured and a membrane protein, OmpF, is reconstituted in membrane and the changes in permeability are measured.

Die synthetische bottom-up-Biologie zielt darauf ab, biologische Zellen von Grund auf neu zu konstruieren. Diese Arbeit zeigt, wie die Mikrofluidiktechnologie zur Herstel- lung, Beobachtung und Manipulation von Modellmembranen verwendet werden kann, wobei der Schwerpunkt auf Anwendungen der synthetischen bottom-up-Biologie liegt. Eines der Merkmale des Lebens ist die Kompartimentierung. Häufig verwendete Model- lkompartimente sind Lipidvesikel, insbesondere riesige unilamellare Vesikel (GUV). Ob- wohl es eine Reihe etablierter Methoden zur Herstellung von GUVs gibt, müssen neue Methoden entwickelt werden, um den modularen Aufbau von Zellen zu ermöglichen. Ins- besondere soll ein breites Spektrum an biologischen Teilen und Modulen während der Produktion mit hoher Effizienz in die Vesikel eingebracht werden. In diesem Zusam- menhang zeigt das zweite Kapitel der Arbeit, wie Mikrofluidiktechnologie verwendet werden kann, um monodisperse Kompartimente mit einer höheren Einschlusseffizienz als die derzeitigen Standardmethoden, wie z.B. Elektroformmation, herzustellen. Nach der Produktion von Doppelemulsionen werden verschiedene Ansätze zur Entfernung von Resten organischer Phase getestet, um Phospholipiddoppelmembranen zu erhalten. Anschließend wird die Integration anderer komplexer Module wie Energieversorgung und Stoffwechselreaktionen mit den Kompartimentmodulen getestet. Zunächst wird ein Energiemodul aus invertierten Membranvesikeln (IMV) entwickelt. Das Modul wird durch Batch-Experimente charakterisiert und später mit Hilfe eines Mikrofluidiksys- tems in Wasser-in-Öl-Tröpfchen eingeschlossen. Das zweite Kombinationsexperiment nutzt die zuvor entwickelte Methode zur Produktion von Vesikeln mittels Mikroflu- idik um einen komplexen Stoffwechselweg, den CETCH Zyklus, in Doppelemulsionen einzuschließen. Eine weitere Herausforderung, bei der mikrofluidische Systeme verwendet werden, ist die Messung von Prozessen innerhalb von Kompartimenten oder an deren Membran. Dafür werden neue Methoden benötigt, da in der Molekularbiologie übliche Methoden häufig nicht geeignet sind. Zum Beispiel ist das Volumen der Lösung im Inneren des Vesikels im Vergleich zum Volumen der äußeren Lösung verschwindend gering. Infolgedessen sind Fluoreszenzänderungen im Inneren der Vesikel in Batch-Experimenten nur schwer mess- bar und Messungen eines einzelnen Vesikels sind sehr schwierig oder nicht möglich. Es wird ein mikrofluidisches Design für die Immobilisierung von GUVs und dem Austausch der äußeren Lösung vorgestellt, mit dem solche Messungen ermöglicht werden sollen. Die Möglichkeiten und Grenzen dieses Systems werden anhand eines Membrantrans- portassays untersucht. Der Einfluss von Lipidzusammensetzung und Detergenzien auf die Membranpermeabilität und auf ein Membranprotein, welches in die Membran einge- bracht wird, werden gemessen.